基于碳量子点/氧化锌纳米复合材料的CYFRA 21-1快速高灵敏荧光免疫分析

摘要

利用肿瘤标志物细胞角蛋白-19片段（CYFRA 21-1）在人血清中早期快速检测肺癌，对患者生存及快速手术决策至关重要。本研究旨在利用绿色合成的碳量子点（CQDs）偶联氧化锌纳米复合材料，构建高灵敏荧光免疫传感体系，实现CYFRA 21-1抗原在人血清中的快速测定。方法采用水热法以柠檬皮为碳源制备CQDs，所得CQDs作为还原稳定剂合成CQDs-ZnO纳米复合材料。构建三明治封顶抗体-抗原-抗体免疫传感体系：将非偶联单克隆抗体BM 19.21固定在CQDs-ZnO表面，另一单克隆抗体KS 19.1包被于微孔板孔底。该体系在激发/发射波长λex=470 nm、λem=520 nm处具有可调荧光特性。线性范围0.01–100 ng/mL，检测限0.008 ng/mL。基于CQDs-ZnO纳米复合材料的免疫传感系统为肺癌早期快速诊断提供了极具前景的新方法。

引言

肺癌是最常见且侵袭性最强的癌症类型，治疗挑战巨大。肿瘤复发和转移是肺癌患者死亡的主要原因[1]。细胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）存在于许多正常及恶性上皮细胞中[2]，可用三明治免疫放射测定法测定。早期研究证实，肺癌恶性阶段CYFRA 21-1释放入血循环并在血清中升高[3]，因此早期检测并快速手术反应可提高生存率[4]。

此前报道的CYFRA 21-1检测技术包括酶免疫分析[5]、电化学发光免疫分析[6]、免疫放射测定[7]，提高其在血清中检测灵敏度的策略仍是研究热点。

近年来纳米技术在生命领域爆发式增长[8]，涉及药物递送[9]、药物分析[10]、催化反应[11]、医药应用[12]、癌症肿瘤标志物[13]、组织成像[14]等。荧光(FL)传感技术因设计简单、灵敏度优异备受青睐[15]。生物检测用FL系统具备高发光、水分散、化学稳定、无毒等特性。各类免疫传感荧光探针用于生物标志物检测：异质竞争法将捕获分子固定表面孵育荧光标记生物标志物，游离与标记生物标志物竞争结合导致荧光随浓度降低[16]；异质三明治法孵育捕获分子与待测液形成复合物，荧光随浓度升高[17]；均相竞争法中两种不同荧光基团标记的捕获分子和生物标志物竞争，荧光随浓度升高[18]。但这些技术存在实验周期长、缺乏多重检测、复杂、有时结果偏假等缺点。纳米技术进步使开发具有独特光学特性的新型荧光免疫传感探针成为可能[19]。量子点用于生物分子检测以来，因光学特性提供波长选择灵活性、多重检测优异标记、生物相容性和靶向能力而备受关注[20]。

碳量子点（CQDs）展现优异化学、物理、光学、磁学、电学性质。合成方法包括水热、电化学氧化、激光烧蚀、微波法[21-24]。因低毒性，CQDs被视为荧光探针强有力候选者。且能通过可控化学反应在生化、光化学、生物传感、生物成像、药物递送[25-27]及免疫分析[28]中灵活应用。早期CQDs合成存在碳源昂贵、试剂有毒、工艺非选择性等劣势[29]。为克服这些，研究者开始用果汁作为新型廉价碳源[30]。因果汁利用资源非最优，近期从果皮制得荧光CQDs[31]，果皮利用为CQDs绿色环保合成提供了新路径。

氧化锌（ZnO）是重要、高活性、稳定、低毒金属氧化物，广泛用于紫外激光器件、生物医学、各类传感器、光催化[32-35]。ZnO纳米颗粒显示近紫外和可见光谱区光致发光特性，归因于电子-空穴对直接复合的激子发射[36]或导带边缘至陷阱能级电子跃迁产生的520 nm绿黄发射[37]。

碳点通常为非晶或纳米晶准球形纳米颗粒，含sp²/sp³碳、O/N基团、后修饰化学基团。CQDs能以更高波长激发，改变电子-空穴对复合表面效应并处理体系淬灭，便于生物分子定量分析[38]。可被TiO₂、ZnO等金属氧化物修饰形成光学活性纳米复合材料，用于血清生物标志物检测。ZnO宽禁带(3.37 eV)，因带隙中高密度缺陷能级可在紫外和蓝光区发光[39]。CQDs/ZnO纳米复合材料形成增加可见光吸收（CQDs与ZnO杂化），发光吸收蓝移至520 nm归因于电离氧空位辐射复合。此外，界面电子转移时间缩短、电子-空穴分离改善可提升杂化光电性能[40]。CQDs/ZnO纳米复合材料水界面产生更多·OH自由基显著增强分析体系荧光信号。因此复合材料增强ZnO表面光电和光致发光性质，产生可调光致发光的强表面缺陷[41]。而且CQDs固定生物识别抗体形成抗体-抗原-抗体FL传感系统，提供高特异性高灵敏度靶标分析探针[42]。

本研究提出基于CQDs修饰ZnO纳米复合材料的新型简便超灵敏免疫分析荧光传感系统，检测人血清中肿瘤标志物CYFRA 21-1。以柠檬皮为碳前驱体水热制备CQDs，同时作为还原稳定剂合成CQDs-ZnO纳米复合材料。制备的CQDs/ZnO纳米复合材料经非偶联BM 19.21单克隆抗体(mAb)固定，微孔孔底包被另一单克隆KS 19.1抗体，构建三明治封顶免疫传感系统。

材料与方法

仪器设备

CQDs及CQDs/ZnO纳米复合材料分光光谱用Ultrospec 2100-Biochrom分光光度计(英国Biochrom)。透射电镜(TEM) JEOL 1200EX(德国JEOL)和扫描电镜(SEM) JSM-7610F(美国JEOL)表征形貌和粒径分布。荧光和傅里叶变换红外(FT-IR)光谱用Biotek Synergy H1多模式读板机(日本Biotek)和PerkinElmer FT-IR分光光度计(日本PerkinElmer)。拉曼光谱、X射线光电子能谱(XPS)、X射线粉末衍射(XRD)分别用微拉曼光谱仪(美国CRAIC)、Kratos Axis Ultra X射线光谱系统(英国Kratos)、西门子D-5000衍射仪(德国西门子)测定。

化学品与试剂

全程去离子水用SG-2000-10090仪器(德国Barsbuttel)制备。构建三明治封顶免疫传感系统用的CYFRA 21-1非偶联单克隆抗体BM 19.21和KS 19.1购自Abcam(英国剑桥)。柠檬当地市场采购。pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)用氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠配制(英国BHD)。Randox Laboratories(北爱尔兰)提供商业正常血清。健康志愿者随机采血，知情同意。EDC和NHS纯品购自Sigma-Aldrich(德国汉堡)。沙特国王大学研究伦理委员会批准(KSU-REC-002-E, 2019)。

碳量子点(CQDs)绿色水热制备

约20 g柠檬皮与200 mL去离子水置圆底烧瓶，100°C磁力搅拌回流6 h。冷却至室温后离心(3500 rpm)，取上层提取液20 mL高压灭菌，100–200°C水热条件下反应6–120 h不同时间。冷却后上层液即为CQDs(方案1)。

碳量子点-氧化锌纳米复合材料制备

以CQDs为还原稳定剂进行简单化学还原反应制备CQDs/ZnO纳米复合材料。将20 mL CQDs加入50 mL 5.0×10⁻² mol/L乙酸锌，60°C连续搅拌10 min。混合液颜色由淡黄变奶白色后静置30 min完成还原，4°C保存。用UV-Vis分光光度法在390 nm监测20天吸光度，验证稳定性及团聚情况。结果显示CQDs/ZnO纳米复合材料稳定性高，吸光度无显著变化。

碳量子点-氧化锌纳米复合材料表征

用高分辨透射电镜(HRTEM)、SEM研究CQDs及CQDs/ZnO纳米复合材料均一性和表面形貌。UV-Vis、FT-IR、XPS、拉曼光谱研究光谱性质。XRD衍射图谱评估CQDs晶体结构。

固定化过程

非偶联单克隆BM 19.21抗体通过氨基与活性羧基形成简单肽键固定在合成CQDs/ZnO纳米复合材料表面。工艺：等摩尔3.0×10⁻³ mol/L NHS和EDC各5.0 mL加入5.0 mL CQDs/ZnO纳米复合材料溶液，连续搅拌1 h。约5 mg BM 19.21抗体溶于1.0 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)加入上述传感溶液。37°C孵育12 h后抗体固定在CQDs/ZnO纳米复合材料表面(方案2)。分光光度法确认固定化成功。

免疫分析方法总体原理

另一单克隆KS 19.1抗体包被微孔板孔底形成三明治封顶抗体-抗原-抗体反应(方案3)。最佳免疫分析条件下，CYFRA 21-1抗原浓度作为荧光信号强度增加的函数测定。

免疫传感检测步骤

人血清标本由随机志愿者提供。室温离心确保完全凝固，4°C保存。加标法制备0.01–500 ng/mL CYFRA 21-1抗原标准样品。每孔加入50 μL加标样品与50 μL新稀释KS 19.1抗体(PBS pH 7.4)混合30 min，37°C孵育1 h不盖盖。甩干孔内液体，去离子水(300 μL/孔)洗涤三次。加入50 μL固定化CQDs/ZnO-BM 19.21纳米复合材料溶液，轻柔混合，37°C孵育30 min。微孔板读板机荧光分析记录强度。

结果与讨论

碳量子点及其纳米复合材料形貌评价

透射电镜(TEM)表征CQDs表面形貌和分布。约4 μL CQDs悬浮液滴加碳膜网格。HRTEM图(图1a)观察到均匀黑点，晶格间距0.36 nm，证实CQDs形成。粒径分布图平均粒径1.5±0.5至5.0±0.5 nm(图1b)，符合量子尺度纳米材料。动态光散射(DLS)平均粒径~20±0.2 nm。两次测量差异归因于：HRTEM高倍率下因非晶性质不显示晶格结构[43]；本研究柠檬皮前驱体衍生CQDs亦呈非晶性质；团聚、非晶本质、实验机制差异、颗粒水化动力学导致粒径测量差异。

CQDs/ZnO纳米复合材料经TEM和SEM表征。TEM图(图2a)见附着于CQDs的六方颗粒，证实复合材料形成。SEM镀金防电子吸收积聚，加速电压15 kV，放大30,000倍(图2b)。

CQDs UV-Vis和荧光光谱显示224和280 nm两显著峰，分别归因于C=C的π-π*和C=O的n-π*跃迁。荧光光谱最大激发/发射λex=360 nm、λem=453 nm(图3a,b)。CQDs/ZnO纳米复合材料UV-Vis光谱在370 nm观察到显著吸收峰，蓝绿移(图4a)。光致发光(PL)性质研究：CQDs尺寸和表面缺陷大幅影响发光性质。随激发波长变化PL发射[38]。ZnO纳米颗粒在蓝绿可见区显示缺陷相关发射[41]。故CQDs修饰ZnONPs产生优异PL发射纳米复合材料。图4b显示CQDs/ZnO PL光谱在470 nm激发下520 nm处显著峰，蓝移归因于CQDs和ZnONPs能带重叠，位于缺陷发射能级2.1 eV。

比较FT-IR研究确认CQDs/ZnO纳米复合材料形成及抗体固定化。CQDs FT-IR谱(图5a)显示3462和2932 cm⁻¹伸缩振动峰对应C-OH和C-H；1749、1375、1246 cm⁻¹三振动吸收带对应C=O、C-N、C-O-C。CQDs/ZnO纳米复合材料新峰436 cm⁻¹对应Zn-O伸缩振动(图5b)。CQDs表面-OH和COOH基团提供电子、对复合材料形成有强亲和力，故CQDs还原稳定纳米复合材料。固定化CQDs/ZnO-BM 19.21纳米复合材料(图5c)出现3254和1675 cm⁻¹两新峰，分别归因于N-H和C=O伸缩振动，确认经肽键固定化。

XPS谱(图6a)显示CQDs在288和286 eV处C=O和COOH官能团。Zn 2p₁/₂和Zn 2p₃/₂两显著结合能峰分别在1044.4和1021.5 eV(图6b)。CQDs/ZnO纳米复合材料高分辨XPS谱(图6c)确认O 1s、C 1s、Zn 3s、Zn 3p、Zn 3d结合能峰分别在560、385、350、246、200 eV。所有数据证实ZnO存在于CQDs表面形成复合材料。

CQDs和CQDs/ZnO纳米复合材料XRD图谱比较(图7)。CQDs XRD图谱2θ=20°处宽峰(图7a)；CQDs/ZnO纳米复合材料在27°、32°、34°、45°、57°、64°、67°、70°、73°、78°、80°(2θ)出现尖锐峰，分别对应Zn(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)、(200)、(112)、(201)、(004)、(202)晶面(图7b)，反映ZnO分布于CQDs表面形成复合材料。

CQDs、CQDs/ZnO、固定化CQDs/ZnO-BM 19.21纳米复合材料拉曼光谱研究(图8)。CQDs显示碳纳米颗粒典型D带和G带分别在1300和1520 cm⁻¹(图8a)。D带代表sp³缺陷，G带为sp²键合碳平面振动特征[44]。CQDs ID/IG比为1.02±0.03。CQDs/ZnO纳米复合材料观察到440和520 cm⁻¹ ZnO纳米颗粒新尖峰，CQDs典型峰在1364和1595 cm⁻¹，ID/IG比为1.2±0.01，证实复合材料形成(图8b)。固定化复合材料拉曼谱显示众多峰可识别为二级和三级结构确证信号。1007–1128 cm⁻¹区峰代表单克隆抗体主要二级结构；550–682 cm⁻¹区峰代表二硫键构象；867–797 cm⁻¹区峰代表酪氨酸残基氢键状态；1630 cm⁻¹显著位移归因于固定化抗体三级结构[45](图8c)。ID/IG比增至1.4±0.04，显示固定化后结晶结构更好。

荧光免疫传感条件优化

通过研究各参数选择优化荧光免疫传感条件。一般需考察固定化纳米复合材料用量、缓冲液pH和浓度、血清样品中靶标分析物与免疫传感试剂孵育时间。测试10–100 μL不同量固定化CQDs/ZnO-BM 19.21纳米复合材料，50 μL时荧光强度最大(图9a)。配制pH 7.2–7.5四种PBS测荧光强度。pH 7.2和7.3时荧光信号降低，因固定化复合材料化学不稳定；pH 7.4–7.5信号增加，因纳米复合材料表面单克隆分子间相互作用优异(图9b)。pH>7.5可能分解靶标抗原，故选pH 7.4为最佳继续研究。

PBS浓度0.01–0.05 mol/L影响荧光强度。0.01 mol/L获最大荧光信号。高浓度导致固定化复合材料团聚，免疫传感溶液不稳定致荧光降低(图9c)。免疫反应时间10–60 min测定，≥30 min获最大荧光信号(图9d)。

分析定量

优化条件下，12份0.01–500 ng/mL CYFRA 21-1抗原血清样品免疫分析。标定曲线在0.01–100 ng/mL线性相关，检测限0.008 ng/mL。回归方程IF=7.933C+181.24(r²=0.9992)。六次重复相对标准偏差(%RSD)1.3%。结果显示免疫传感荧光法对血清CYFRA 21-1抗原定量具有高灵敏度。

系统适用性

对比建议的固定化CQDs/ZnO-BM 19.21免疫传感法与前文方法。荧光系统具简便、环保、易检测血清靶标分析物等显著优势。结果显高灵敏度，宽线性检测范围0.01–100 ng/mL，低检测限0.008 ng/mL(表1)。

固定化免疫传感系统准确度、精密度、选择性

为确保准确度，12份血清样品测试，数据与电化学发光法[6](三(2,2'-联吡啌)钌(II)络合物经三丙胺激发)比较。结果可接受(表2)。日内和日间精密度用10 ng/mL CYFRA 21-1血清样品考察。平均相对标准偏差分别为1.1%和1.3%，显示高精密度。选择性评价用可能干扰物：氨基酸(半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸)、阳离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)、其他生物标志物(CA 15-3、CA 27-29、CA 19-9、CA 125)。最佳条件下含10 ng/mL CYFRA 21-1血清中加入10 ng/mL共存物测试。相对百分比误差(Er%)均未超±5%(表3)。容许值(F-F⁰/F⁰)在容许限(<5%)内。故固定化CQDs/ZnO-BM 19.21免疫传感荧光系统对血清CYFRA 21-1抗原测定显示高选择性。

真实样品分析

真实人标本中，利用固定化CQDs/ZnO-BM 19.21溶液免疫传感荧光系统检测定量肿瘤标志物CYFRA 21-1抗原回收率(%)。按免疫传感步骤，通过荧光强度与血清中CYFRA 21-1浓度关系测定。向估计样品加入0.5、1.0、2.0 ng/mL靶标抗原，评估信号增强。六次测定后计算%RSD。回收率96.7±0.7%至100.0±1.3%，%RSD 0.2–1.4%。前文方法[6]测定回收率96.1±1.6%至100.0±0.4%，%RSD 0.3–1.7%。为确保适用性，用Student's t检验和F检验[46]比较本法与前人方法(表4)。t检验值0.354–2.181(临界值2.228*)，F检验值1.16–4.0(临界值5.05*)，P=0.05。结果显示本法与前人方法吻合良好。所有检测血清CYFRA 21-1量均在正常限度，表明受检样本未诊断肺癌。

结论

本研究制备绿色合成CQDs偶联ZnO纳米复合材料(柠檬前驱体)。CQDs/ZnO纳米复合材料经简单肽键固定化单克隆BM 19.21抗体构建新型荧光免疫传感系统。高灵敏荧光系统用于测定人血清中肺癌肿瘤标志物CYFRA 21-1。利用另一单克隆KS 19.1抗体包被微孔孔底，通过三明治封顶抗体-抗原-抗体反应测定CYFRA 21-1抗原。系统独特特性和高灵敏度实现高稳定性、可重复性靶标肿瘤标志物测定。比较研究证实免疫传感系统适用性及高灵敏度，结果与前人常规技术一致。