通过碳量子点/氧化锌纳米复合材料对肿瘤标志物 Cytokeratin-19 片段 (CYFRA 21-1) 进行新型免疫传感荧光检测

介绍

肺癌是最常见、最具侵袭性的癌症类型，在医学治疗上面临巨大挑战。肿瘤复发和转移被认为是肺癌患者死亡的主要原因[1]。肿瘤标志物细胞角蛋白 19 片段 (CYFRA 21-1) 是一种存在于许多正常和恶性上皮细胞中的片段 [2]。它可以使用夹心免疫放射测定法进行估计。早期研究表明，在肺癌的恶性阶段，CYFRA 21-1 被释放到患者的血液循环中并在其血清中升高 [3]。因此，通过早期发现和快速手术反应来提高肺癌患者的生存期是可能的[4]。

以前报道的检测 CYFRA 21-1 的技术很少，包括酶免疫分析 [5]、电化学发光免疫分析 [6] 和免疫放射分析 [7]。 增强和改善人血清中CYFRA 21-1敏感性的有利策略仍然值得关注。

近年来，纳米技术几乎在所有生命领域都取得了重大进展和爆炸式增长[8]。这些领域包括药物递送系统[9]、药物分析[10]、催化活性反应[11]、医学应用[12]、癌症肿瘤标志物[13]和组织成像[14]。

如今，基于荧光（FL）的传感技术由于其简单的设计和出色的灵敏度而吸引了许多研究人员。已经设计和合成了各种用于生物监测的 FL 传感材料。用于生物测定的 FL 系统具有高发光性、水分散性、化学稳定性和无毒 [15]。有多种基于免疫传感荧光的探针用于生物标志物检测。异质竞争分析是通过将捕获分子固定在表面上，然后与荧光团结合的生物标志物一起孵育来进行的。游离生物标志物和结合生物标志物之间与捕获分子结合的竞争会随着生物标志物浓度而降低荧光强度 [16]。异质夹心测定基于捕获分子和感兴趣的溶液的孵育，与生物标志物形成复合物。因此，荧光强度随着生物标志物浓度的增加而增加[17]。

在同质竞争测定中，两种不同的荧光团 A 结合捕获分子与荧光团 B 结合生物标志物结合，溶液随着生物标志物浓度增加荧光 [18]。然而，这些技术显示出某些缺点，包括实验时间长、缺乏多重检测、复杂性，有时结果相对错误。纳米技术的进步使研究人员能够开发出具有独特光学特性的新型荧光免疫传感探针 [19]。自从第一次将量子点用于生物分子检测以来，由于其光学特性在选择合适波长方面提供了高度的灵活性、出色的多重检测标记、生物相容性和靶向能力，因此它们引起了极大的兴趣 [20]。

碳量子点 (CQD) 已表现出优异的化学、物理、光学、磁性和电学特性。 CQD 可以使用不同的技术合成，包括水热法、电氧化法、激光烧蚀法和微波法 [21,22,23,24]。由于其低毒性特征，科学研究人员认为 CQD 是许多荧光探针中的有力候选者。此外，它们在各种需求（例如生化、光化学、生物传感、生物成像和药物递送系统 [25,26,27] 以及免疫测定检测 [28]）中具有很强的通过不同可控化学反应进行操作的能力。早期关于 CQD 合成的研究揭示了使用昂贵的碳源、有毒化学品和试剂或使用非选择性过程的某些缺点 [29]。为了限制这些缺点，研究人员开始使用果汁作为新型廉价的碳源 [30]。由于果汁的使用不能提供利用资源的最佳目标，最近从果皮中获得了荧光 CQD [31]。果皮的利用为CQDs的环保、绿色合成提供了一条有前景的途径。

氧化锌 (ZnO) 是最重要的、具有潜在活性、稳定和低毒的金属氧化物之一，广泛应用于紫外激光器件、生物医学领域、各种类型的传感器和光催化 [32,33,34,35]。 ZnO 纳米粒子 (ZnONPs) 显示出接近紫外和可见光谱范围的光致发光特性。这可归因于基于电子-空穴对直接复合的激子发射 [36] 或由于从导带边缘到陷阱能级的电子跃迁导致 520 nm 处的绿黄色发射[37].

通常，碳点是含有 sp ² 的无定形或纳米晶准球形纳米粒子 和 sp ³ 碳、基于 O/N 的基团和后修饰的化学基团。此外，CQD 具有以更高波长激发的能力，可以改变电子 - 空穴对组合表面的功效，并处理分析系统中的猝灭，这可能有助于生物分子的定量测定 [38]。它们能够被金属氧化物（如 TiO2 和 ZnO）修饰，形成光学活性纳米复合材料，可用于检测人血清中的生物标志物。 ZnO 是一种宽带隙材料（3.37 eV），由于带隙中存在大量缺陷能级，因此可以在可见光的紫外和蓝色区域发光[39]。由于 ZnO 与 CQD 的杂化，CQDs/ZnO 纳米复合材料的形成增加了可见光吸收，并且发光吸收蓝移至 520 nm 可归因于电离 O 空位的辐射复合。除了增加可见光的吸收外，更好的电子-空穴分离和界面电子转移时间的减少也可以考虑用于具有 ZnO 纳米粒子的杂化 CQD 的更高光学性能 [40]。此外，水界面中由 CQDs/ZnO 纳米复合材料产生的 –OH* 自由基的显着增加会导致分析系统的荧光信号显着升高。因此，组合的 CQDs/ZnO 纳米复合材料增强了 ZnO 表面的光电和光致发光特性的改性，并产生了具有可调光致发光的强表面缺陷 [41]。此外，固定有生物识别抗体的CQDs形成抗体-抗原-抗体FL-传感系统，提供了一种对靶标分析物具有高特异性和敏感性的可行探针[42]。

建议的研究提出了一种新的简单且超灵敏的免疫测定荧光传感系统，该系统基于用 ZnO 纳米复合材料装饰的 CQD，以确定人血清中的肿瘤 CYFRA 21-1 标志物。柑橘柠檬果皮被用作碳前体，使用水热条件衍生出 CQD。此外，它还用作合成 CQDs 共轭 ZnO 纳米复合材料的还原剂和稳定剂。制备的CQDs/ZnO纳米复合材料由非偶联的BM 19.21单克隆抗体（mAb）固定，微孔包被另一种单克隆KS 19.1抗体，形成夹心封盖免疫传感系统。

方法

仪器

使用 Ultrospec 2100-Biochrom 分光光度计（Biochrom Ltd.，Cambium，Cambridge，UK）记录 CQD 和 CQDs/ZnO 纳米复合材料的分光光度谱。使用透射电子显微镜 (TEM) JEOL 1200EX 模型仪器 (JEOL Ltd., Freising, Germany) 和扫描电子显微镜 (SEM) JSM-7610F 模型评估绿色合成的 CQD 和 CQDS/Zn 纳米复合材料的表面形貌和粒度分布（JEOL，美国）。使用 Biotek Synergy H1 多模式阅读器（Biotek，Tokyo，Japan）和 Perkin Elmer FT-IR 分光光度计（PerkinElmer Ltd.，Yokohama，Japan）检查建议免疫传感系统的荧光和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱， 分别。使用微拉曼光谱仪（CRAIC Technologies，CA，USA）、Kratos Axis Ultra X 射线光谱系统（Kratos Analytical Ltd. , Manchester, UK) 和 Siemens D-5000 衍射仪 (Siemens, Erfurt, Germany)。

化学品和试剂

SG-2000-10090 仪器（Barsbuttel，德国）用于获取所有实验中使用的去离子水。 CYFRA 21-1-非偶联单克隆抗体 (mAb) BM 19.21 和 KS 19.1 形成夹心封盖免疫传感系统从 Abcam（剑桥，英国）获得。 柑橘柠檬 水果由当地市场供应。使用氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、磷酸二氢钾和磷酸二钠 (BHD Ltd. Co. Poole, UK) 制备 pH =7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。 Randox Laboratories (Northern Ireland-UK) 好心提供了商业正常血清。从健康志愿者中收集随机血液样本，并在开始本研究之前获得知情同意。此外，Sigma-Aldrich（德国汉堡）提供纯品级的碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)。沙特国王大学研究伦理委员会 (KSU-REC-002-E, 2019) 批准了该研究。

碳量子点 (CQD) 的绿色水热制备

柑橘柠檬 果皮用于在水热条件下合成 CQD。 柑橘柠檬 约20 g 将果皮和200 mL去离子水转移到圆烧瓶中，在100 °C下连续磁力搅拌回流6 小时。冷却至室温后，将所得提取物以 3500 rpm 离心，将 20 mL 上层提取液高压灭菌，并在水热条件下在 100-200 °C 的温度范围内加热 6-120 h 的不同时间间隔。冷却至室温后，上层液体代表 CQD（方案 1）。

使用柑橘柠檬绿色合成CQDs 果皮对荧光 CQD 溶液和碳球的作用

碳量子点-氧化锌纳米复合材料的制备

为了制备 CQDs/ZnO 纳米复合材料，使用 CQDs 作为还原剂和稳定剂进行简单的化学还原反应。通过将 20 mL 的 CQDs 添加到 50 mL 的 5.0 × 10 ^-2 中获得 CQDs/ZnO 纳米复合材料 mol L ^-1 醋酸锌在 60 °C 下连续搅拌 10 分钟。当混合物的颜色由淡黄色变为奶油色时，将混合物放置30 分钟以完成还原过程并在4 °C下储存。为确保稳定性并检查制备的 CQDs/ZnO 纳米复合材料的团聚，采用紫外-可见光谱法记录 20 天内在 390 nm 处的吸光度。结果表明，CQDs/ZnO纳米复合材料具有较高的稳定性，吸光度无明显变化。

碳量子点-氧化锌纳米复合材料的表征

为了确保 CQDs/ZnO 纳米复合材料的形成，使用了不同的显微和光谱技术。使用高分辨率透射电子显微镜 (HRTEM) 和 SEM 研究了 CQDs 和 CQDs/ZnO 纳米复合材料的均匀性和表面形貌。使用 UV-Vis、FT-IR、XPS 和拉曼光谱研究光谱。使用XRD图谱评估了制备的CQDs的晶体结构。

固定过程

非偶联的单克隆 BM 19.21 抗体通过胺和活性羧基之间的简单肽酰胺键固定在合成的 CQDs/ZnO 纳米复合材料的表面上。通过加入5.0 mL各等摩尔的3.0 × 10 ^-3 进行固定化过程。 mol L ^-1 在连续搅拌 1 小时的条件下，NHS 和 EDC 加入 5.0 mL 的 CQDs/ZnO 纳米复合溶液。将大约 5 mg 的非偶联单克隆 BM 19.21 抗体溶解在 1.0 mL 的 0.01 mol L ^-1 中 磷酸盐缓冲盐水（pH =7.4）并添加到上述传感溶液中。在 37 °C 下孵育 12 小时后，将未偶联的单克隆 BM 19.21 抗体固定在 CQDs/ZnO 纳米复合溶液的表面上（方案 2）。分光光度法用于确认固定过程的成功。

单克隆BM 19.21抗体在CQDs/ZnO纳米复合材料表面的固定化

免疫测定法的一般原理

使用另一种单克隆 KS 19.1 抗体包被微量滴定孔表面获得夹心加帽反应抗体-抗原-抗体（方案 3）。在最佳免疫测定条件下，CYFRA 21-1抗原的浓度被确定为荧光信号强度增加的函数。

图示为夹心加帽免疫传感抗体-抗原-抗体反应

免疫传感程序

人血清标本采集由随机志愿者提供。在室温下离心前确保完全凝固，并在 4 °C 下储存。使用加标技术制备含有 CYFRA 21-1 抗原的标准样品，浓度范围为 0.01–500 ng mL ^-1 .将大约 50 μL 的加标样品分配到微量滴定孔中，并使用 pH =7.4 的磷酸盐缓冲盐水与 50 μL 新鲜稀释的单克隆 KS 19.1 抗体混合 30 分钟，然后在 37°C 下不覆盖板孵育 1 小时。快速摇出孔内的内容物，每孔用去离子水（300 μL）冲洗3次。将大约 50 μL 的固定化 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合溶液添加到每个孔中，轻轻混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。制备的样品用酶标仪进行荧光分析，记录强度。

结果与讨论

碳量子点及其纳米复合材料的形态评估

透射电子显微镜 (TEM) 用于表征样品中 CQD 的表面形态和分布。为了完成 TEM 下的检查，将大约 4 μL 制备的 CQDs 悬浮液滴在 TEM 的碳网格表面。在 HRTEM 图像（图 1a）中，观察到的具有晶格间距（0.36 nm）的均匀黑点表明 CQD 的形成。绘制了粒度分布图，平均粒度范围为 1.5 ± 0.5 至 5.0 ± 0.5 nm（图 1b）。获得的粒径证明形成的CQDs确实是量子尺寸的纳米材料。此外，进行了动态光散射 (DLS)，发现平均粒径为~20 ± 0.2 nm。观察到前两次测量之间的差异。先前的研究表明，由于其非晶性质，HRTEM 在更高的放大倍数下不会显示形成的 CQD 的晶格结构 [43]。同样，在这项研究中，碳的天然前体是柑橘柠檬 果皮和衍生的 CQDs 也表现出无定形的性质。因此，粒径测量值的差异可归因于形成的 CQDs 的团聚、形成的碳点的无定形性质、每个实验中涉及的机制以及颗粒的水化动力学。

一 直径为 5 nm 和 b 的 CQD 的高分辨率透射电子显微镜 (HRTEM) 图像 基于TEM的CQDs尺寸分布图

使用 TEM 和 SEM 研究制备的 CQDs/ZnO 纳米复合材料。在 TEM 图像（图 2a）中，附着在 CQDs 上的六边形颗粒的存在表明 CQDs/ZnO 纳米复合材料的形成。在 SEM 中，纳米复合材料样品涂有金，以防止样品吸收电子和电荷积累。施加的加速电压为 15 kV，放大倍数 × 30,000（图 2b）。

一 和 b 表示CQDs/ZnO纳米复合材料的透射电子显微镜和扫描电子显微镜图像

研究了CQDs的UV-Vis和荧光光谱，记录的光谱在224和280 nm处有两个明显的峰，这可以归因于p ~p* 和 n ~P* C=C 和 C=O 的转变，分别。此外，CQD 的荧光光谱在最大 λex =360 和 λem =453 nm 处显示两个信号（图 3a、b）。此外，研究了 CQDs/ZnO 纳米复合材料的 UV-Vis 光谱。在 370 nm 处观察到显着的吸收峰，显示蓝绿位移（图 4a）。研究了 CQDs/ZnO 纳米复合材料的光致发光 (PL) 特性。 CQDs的尺寸和表面缺陷极大地影响了它们的发光性能。作为激发波长的函数，CQD 的 (PL) 发射是变化的 [38]。此外，ZnO 纳米颗粒在蓝色到绿色吸收可见光区表现出与缺陷相关的发射 [41]。因此，CQD 装饰的 ZnONPs 产生了一种优异的 PL 发射纳米复合材料。如图 4b 所示，CQDs/ZnO 的 PL 光谱表现出蓝移，在激发波长 470 nm 后在 520 nm 处出现显着峰值。观察到的转变可归因于 CQDs 和 ZnONPs 能带之间的重叠。显示的蓝移在缺陷发射水平2.1 eV。

CQDs 的光谱 (a ) UV-Vis 光谱在 224 和 280 nm 和 (b ) CQDs在λex =360和λem =452 nm处的荧光光谱

CQDs/ZnONPs的光谱a UV-Vis 光谱在 370 nm 和 b 处的吸收峰 CQDs/ZnONPs在λex =470和λem =520 nm处的光致发光光谱

为了证实 CQDs/ZnO 纳米复合材料和固定化 CQDs/ZnO 纳米复合材料与非偶联单克隆 BM 19.21 抗体的形成，进行了比较 FT-IR 研究。记录的 CQDs 的 FT-IR 光谱揭示了对应于某些官能团的不同不同峰的存在，包括在 3462 cm ^-1 的伸缩振动峰 和 2932 cm ⁻¹ 分别为 C-OH 和 C-H 基团。此外，在1749 cm ^-1 处观察到三个振动吸收带 , 1375 cm ⁻¹ , 和 1246 cm ⁻¹ 分别对应于 C=O、C-N 和 C-O-C 官能团的存在（图 5a）。 436 cm ⁻¹ 处的新峰 观察到对应于 Zn-O 的伸缩振动带。 CQDs 的还原和稳定特性是由于其表面存在 –OH 和 COOH 基团而获得的。这些官能团作为电子供体，对 CQDs/ZnO 纳米复合材料的形成具有很强的亲和力。因此，CQD 减少并稳定了形成的纳米复合材料（图 5b）。如图 5c 所示，注意到在 3254 cm ^-1 处形成了两个新峰 和 1675 cm ⁻¹ .这些峰分别归因于 N-H 和 C=O 的伸缩振动，并证实了 CQDs/ZnO-BM 19.21 通过肽键的固定。

a的红外光谱 CQD，b CQDs/ZnO 纳米复合材料和 c 固定化CQDs/ZnO-BM 19.21纳米复合材料

检查了绿色合成的 CQD 的 X 射线光电子能谱 (XPS) 光谱。获得的 CQD 光谱（图 6a）分别在 288 和 286 eV 处显示了 C=O 和 COOH 的不同官能团。此外，对于 Zn 2p1/2 和 Zn 2p3/2，分别在 1044.4 和 1021.5 eV 处观察到两个显着的结合能峰（图 6b）。此外，CQDs/ZnO 纳米复合材料的高分辨率 XPS 光谱证实，O 1s、C 1s、Zn 3s、Zn 3p 和 Zn 3d 在 560、385、350、246 和 200 eV 处存在不同的结合能峰，分别（图 6c）。前面提到的所有数据都证明了在形成 CQDs/ZnO 纳米复合材料的 CQDs 表面存在 ZnO。

a 的 X 射线光电子能谱 (XPS) 光谱 CQD，b 氧化锌和c CQDs/ZnO纳米复合材料

进行了 CQDs 和 CQDs/ZnO 纳米复合材料的 XRD 图案之间的比较研究。在 CQD 的 XRD 图中注意到碳点在 20°（2Ɵ）处的宽峰（图 7a）。然而，对于 Zn (100)，在 27°、32°、34°、45°、57°、64°、67°、70°、73°、78°和 80° (2Ɵ) 处发现了不同的尖峰， (002)、(101)、(102)、(110)、(103)、(200)、(112)、(201)、(004)和(202)分别。观察到的峰反映了 ZnO 在形成 CQDs/ZnO 纳米复合材料的 CQDs 表面的分布（图 7b）。

a 的 X 射线衍射图 CQD 和 b CQDs/ZnO纳米复合材料

研究了制备的 CQDs、CQDs/ZnO 和固定化 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合材料的拉曼光谱。拉曼信号通常用于研究晶体结构及其缺陷。图 8a，显示了 1300 和 1520 cm ^-1 处的两个典型 D 和 G 带 分别为碳纳米颗粒。如前所述，D-band 通常代表 sp ³ 缺陷，G 带是 sp ² 平面振动的特征 - 键合碳 [44]。 我 D /我 G 计算制备的 CQD 的比率，发现它是 1.02 ± 0.03。在 440 和 520 cm ^-1 处观察到新的尖峰 对于 ZnO 纳米粒子，在 1364 和 1595 cm ^-1 处观察到 CQDs 的典型峰 . I的比例 D /我 G 发现为 1.2 ± 0.01，表明形成了 CQDs/ZnO 纳米复合材料（图 8b）。固定化 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合材料的拉曼光谱显示出许多峰，这些峰很容易被识别为二​​级和三级结构的确认标志。在 1007–1128 cm ⁻¹ 区域观察到的峰值 被指定代表单克隆抗体的主要二级结构。拉曼峰值在 550–682 cm ⁻¹ 区域被指定代表二硫化物构象，而 867–797 cm ^-1 一个被指定代表酪氨酸残基的氢键状态。此外，拉曼光谱峰值显着偏移至 1630 cm ⁻¹ 可归因于固定化抗体的三级结构 [45]（图 8c）。 I的比例 D /我 G 由于形成了固定化的 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合材料，因此增加到 1.4 ± 0.04 显示出更好的晶体结构。

a 的拉曼光谱位移 CQD，b CQDs/ZnO 纳米复合材料和 c 固定化CQDs/ZnO-BM 19.21纳米复合材料

荧光免疫传感条件的优化

通过研究各种参数来选择和优化建议的荧光免疫传感条件。通常，应研究和优化固定化纳米复合材料的量、所用缓冲液的 pH 值和浓度、血清样品中目标分析物之间的孵育时间以及免疫传感试剂。为了选择合适数量的固定化 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合材料，测试了 10-100 μL 范围内的不同数量。通过添加 50 μL 的固定化 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合材料观察到最大荧光强度（图 9a）。制备了四种 pH 值 7.2–7.5 的磷酸盐缓冲盐水溶液，并根据荧光强度进行了测试。通过改变 pH 值观察到荧光信号强度的轻微变化。在 pH 7.2 和 7.3 时，由于固定化 CQDs/ZnO 纳米复合材料的化学不稳定性，荧光信号降低。由于纳米复合材料表面上单克隆分子之间的良好相互作用，荧光信号在 pH 7.4 到 7.5 时增加（图 9b）。发现7.4是维持靶抗原活性的最合适的pH值，靶抗原可能通过将pH升高超过7.5而被分解。因此，选择pH 7.4进行进一步研究。

CYFRA 21-1 抗原在 λex =470 和 λem =520 nm 下的荧光测定的优化。 一 添加固定化 CQDs/ZnO-BM 19.21 纳米复合材料的影响，b pH 范围 7.3-7.5 的磷酸盐缓冲盐水的影响，c 0.01–0.05 mol L ⁻¹ 使用PBS缓冲液浓度的影响 , 和 d 10-60 min对免疫反应时间的影响

使用0.01-0.05 mol L ^-1 的浓度范围估计磷酸盐缓冲盐水浓度对荧光强度的影响 .使用0.01 mol L ^-1 的缓冲液浓度获得最大荧光强度信号 . At higher buffer concentrations, the immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposite was aggregated, and the instability of the immunosensing solution may cause a decrease in fluorescence intensity (Fig. 9c). To calculate the immunoreaction time, the analytical procedure was repeated using reaction time ranging from 10 to 60 min. The maximum fluorescence intensity signal was observed by maintaining the reaction between the tested antigen and the immunosensing solution for at least 30 min (Fig. 9d).

Analytical Quantification

Under optimized conditions, the suggested immunoassay method was performed using 12 serum samples containing CYFRA 21-1 antigen in concentration range of 0.01–500 ng mL ¹ . The outcome results were plotted to construct the calibration graph which was linear over a concentration range of 0.01–100 ng mL ⁻¹ with a detection limit of 0.008 ng mL ⁻¹ . The calculated equation was found to be I F  = 7.933C + 181.24 (r ²  = 0.9992). After six repetitions, the percentage of the relative standard deviation (%RSD) was 1.3%. The acceptable results revealed a high sensitivity of the immunosensing fluorescence method for the quantification of CYFRA 21-1 antigen in serum samples.

System Suitability

System suitability was investigated by carrying out a comparative study between the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing method and the previously addressed methods. The suggested fluorescence system provided significant advantages such as simplicity, eco-friendly, and easy to detect the target analyte in serum samples. The recorded results revealed high sensitivity with a wide linear detection range of 0.01–100 ng mL ¹ and lower detection limit of 0.008 ng mL ¹ (Table 1).

Accuracy, Precision, and Selectivity of the Immobilized Immunosensing System

To ensure the accuracy of the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescence immunosensing system for the determination of CYFRA 21-1 antigen in serum samples, 12 serum samples were tested. The outcome data were compared with another previously reported technique [6], which was based on electrochemiluminescence assay using tris 2,2′-bipyridyl ruthenium (II) complex to be excited by tripropylamine. Acceptable results were obtained as indicated in Table 2. Intra-day and inter-day assay were used to investigate the precision of the suggested method. The test was carried out using a serum sample containing 10 ng mL ^− 1 of CYFRA 21-1 antigen. The mean relative standard deviations were 1.1% and 1.3% for both intra- and inter-day assay, respectively, which revealed high precision. Furthermore, the selectivity of the suggested method towards the determination of CYFRA 21-1 antigen was evaluated using some possible interfering species such as amino acids (cysteine, lysine, serine, tyrosine, and glycine), some cations (K ⁺ , Na ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , 和 Zn ²⁺ ) and some other bio-markers such as CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, and CA 125. The test was carried out under optimum conditions using human serum containing 10 ng mL ⁻¹ CYFRA 21-1 antigen in the presence of 10 ng mL ⁻¹ coexisting species. The outcome data were calculated as relative percentage error (Er%) and the corresponding result did not exceed ± 5% for each interfering species (Table 3). The calculated tolerance values (F-F ⁰ /F ⁰ ) were found to be with the tolerance limits (< 5%). Therefore, the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescence system displayed high selectivity towards the determination of CYFRA 21-1 antigen in human serum.

Analysis of Real Specimens

In real human specimens, the suggested immunosensing fluorescence system based on immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution was exploiting to detect and quantify the percentage (%) recoveries of the tumor marker CYFRA 21-1 antigen. As previously mentioned in the immunosensing procedure, the suggested system was used to determine the CYFRA 21-1 antigen by finding the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of CYFRA 21-1 antigen in serum samples. Certain amounts of the target antigen (0.5, 1.0, and 2.0 ng mL ⁻¹ ) were added to the estimated samples, and the increase in signal intensities was evaluated. After six determinations, the percentage relative standard deviations (%RSD) were calculated. The outcome percentage recoveries were found to be ranged from 96.7 ± 0.7 to 100.0 ± 1.3%. The calculated %RSD was in the range of 0.2–1.4%. The tested serum samples were analyzed using a previously reported method [6] and the percentage recoveries were found to be ranged from 96.1 ± 1.6 to 100.0 ± 0.4% with %RSD 0.3–1.7%. In order to ensure the suitability of the suggested immunosensing fluorescence technique using an immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution, a comparative statistical study using Student’s t test and F test [46] was carried out between the present results and those obtained by others from previously conducted methods (Table 4). The obtained t test and F test values were found to be ranged from 0.354 to 2.181 (2.228)* and 1.16 to 4.0 (5.05)* with respect to the tabulated values of P  = 0.05, respectively. The results revealed good agreement between the suggested method and the previously published procedures. Also, all detected quantities of CYFRA 21-1 antigen in serum samples were within the normal limit indicating no lung cancer was diagnosed in the investigated serum samples.

Conclusion

The present study concerned with the preparation of green synthesis CQDs conjugated with ZnO nanocomposite using Citrus lemon as a precursor. The CQDs/ZnO nanocomposite was employed to form a new fluorescence immunosensing system by immobilizing a monoclonal BM 19.21 antibody through simple peptide bonds. The highly sensitive fluorescence system was used to determine the tumor marker of lung cancer (CYFRA 21-1) in human serum. CYFRA 21-1 antigen was determined via sandwich capping antibody-antigen-antibody reaction using another monoclonal antibody KS 19.1 coating the microtiter wells. The unique features and high sensitivity of the suggested system facilitate the determination of the target tumor marker with high stability and reproducibility. A comparative study was carried out and the outcome results confirmed the suitability and high sensitivity of the suggested immunosensing system, and the results were in agreement with a previously reported conventional technique.

数据和材料的可用性

The only outcome data from this study was presented in the manuscript.

缩写

%RSD:

Percentage relative standard deviation

BM 19–21:

Specific monoclonal antibody

CQD：

碳量子点

CQDs/ZnO:

Carbon quantum dots/zinc oxide

CYFRA-21-1:

Cytikeratin-19 fragment

DLS：

动态光散射

EDC：

Carbodiimide hydrochloride

eV:

Electron volt

FT-IR：

傅里叶变换红外

HRTEM：

高分辨透射电子显微镜

KS 19-1:

Monoclonal cytokeratin 19-specific antibody

Ltd. Co:

Limited company

mAb:

Monoclonal antibody

NHS：

N-羟基琥珀酰亚胺

P:

Degree of confidence

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

SEM：

扫描电子显微镜

TEM：

透射电子显微镜

UK:

Unite Kingdom

USA:

United States of America

UV-Vis:

紫外可见

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X射线粉末衍射

氧化锌：

氧化锌

ϴ:

Theta degree

λmax:

Wavelength