用于光热疗法和光声成像的聚吡咯涂层铁铂纳米粒子的合成和体外性能

背景

在过去的十年中，已经为癌症治疗引入了许多新的治疗策略。其中，光热疗法 (PTT) 因其特异性高、时空选择性精确和副作用有限等优点而受到广泛关注 [1, 2]。 PTT 利用近红外区 (NIR) 光吸收剂产生热量，用于在 NIR 激光照射下对癌细胞进行热消融 [2]。近红外光吸收体利用相同波长激光照射的优势，可用于光声成像（PAI）引导的光热癌症治疗[3, 4]。

最近，铁铂纳米粒子 (FePt NPs) 已成为 CT/MRI 双模态成像的有效药物 [5]。 FePt NPs 在 NIR 区域显示出比金纳米粒子更高的光热效率 [6]。与金纳米粒子相比，使用 FePt NPs 产生的光声信号更强，最近也被证明 [7]。用聚合物进行表面改性是一项众所周知的技术，可以提高纳米粒子在癌症治疗中的生物相容性和性能。尽管 FePt NPs 具有良好的性能，但在生物医学应用中对 FePt NPs 的表面改性已经取得了一些研究成果 [8, 9]。

纳米级试剂的光热转化效率高是 PTT 的最重要因素 [10]。因此，选择的用于 FePt NPs 表面改性的材料应该对 FePt NP 核的光热转变没有负面影响。聚吡咯 (PPy) 在 NIR 区域具有强激发，由于其优越的固有特性，包括光热稳定性、低成本和生物相容性 [11, 12]，在生物医学应用中具有重要意义。最近的研究报告称，PPy 是一种用于 PTT 癌症治疗 [11, 13] 和深部组织 PAI [12] 的高性能药物。在目前的工作中，我们开发了 PPy 涂层的 FePt NPs（FePt@PPy NPs）作为结合 PTT 和 PAI 的新型试剂。我们期望使用 PPy 聚合物包覆 FePt NPs 是为了提高 FePt NPs 的光热效应和生物相容性。

由此产生的纳米粒子显示出优异的生物相容性、光热稳定性和强烈的光热效应。 MTT 分析研究表明，FePt@PPy NPs 表现出有效的癌症治疗方法。此外，PAI与FePt@PPy NPs结合的幻像测试显示出强烈的光声（PA）信号，对于PAI的进一步应用非常有希望。

方法

材料

乙酰丙酮铂（Pt(acac)2，97%）购自 Acros Organics 并按原样使用。五羰基铁 (Fe(CO)5, 99%), 十六烷-1,2-二醇 (90%), 油胺 (80–90%), 油酸 (70%), 二辛醚 (90%), 1-十八烯 (90%)、3-巯基丙酸 (3-MPA, 97%)、吡咯（Py，试剂级，98%）、聚乙烯醇（PVA，Mw：9000–10,000）、过硫酸铵 ((NH4)2S2O8, 98 %)、十二烷基硫酸钠 (SDS)、亚铁氰化钾、盐酸和 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 购自 Sigma-Aldrich 并按原样使用在实验过程中。包括台盼蓝、碘化丙啶 (PI) 和 Hoechst 33342 在内的细胞染色试剂也购自 Sigma-Aldrich。 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)、胎牛血清 (FBS)、青霉素、链霉素、1×胰蛋白酶和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 购自 HyClone (South Logan, UT, USA)。所有实验均使用蒸馏水（DI）。

FePt@PPy NPs 的合成

FePt@PPy NPs的合成通过Scheme 1中描述的三个步骤进行。

FePt@PPy NPs合成示意图

第 1 步 - 疏水性 FePt NP 的合成

疏水性 FePt NPs 的合成是根据报道的方案 [5] 完成的。简而言之，加载了 97-mg Pt(acac)2、4-mL 二辛基醚、66-μL Fe(CO)5、195-mg 1,2-十六二醇、100-μL 油胺和 100-μL 油酸装入 50 mL 三颈圆底烧瓶中。在氩气下以15℃/分钟的加热速率将反应混合物加热至240℃。 30 分钟后，将产物冷却至室温。通过离心（15,000 rpm，30 分钟）收集 FePt NP，并用己烷洗涤数次。最终的纳米颗粒溶液储存在己烷中。

第 2 步—配体交换

如文章 [14] 中所报道，疏水性 FePt NPs 表面的配体与 3-巯基丙酸 (3-MPA) 交换。此外，将 1 mL 3-MPA 和 1 mL 环己酮装入离心管中，然后将 0.5 mL 分散在己烷中的疏水性 FePt NP（~ 10 mg）添加到上述溶液中并使用涡旋振荡。 30 分钟后，FePt NP 开始沉淀，所有纳米粒子在 1 小时后沉淀。通过离心（3500 rpm，5 分钟）收集亲水性 FePt NP。产物分别用环己酮、乙醇和丙酮洗涤。最后，亲水性FePt NPs在DI中加入NaOH稀释。

第 3 步 - 用 PPy 涂覆亲水性 FePt NP

将 5 毫克亲水性 FePt NP 溶解在含有 60 毫升 DI 的 200 毫升巴克中，并连续超声处理 10 分钟。然后，将 6 mL 的 40-mM SDS 添加到上述溶液中。接着，将完全溶解在热水中的1-g PVA加入到上述溶液中。然后以500rpm搅拌所得混合物。接下来，将 10 mL 的 6-mM (NH4)2S2O8 添加到搅拌的溶液中。平衡 1 小时后，将 6 mL 100-mM Py 添加到上述溶液中。几分钟后，溶液逐渐变成黑色。聚合 2 小时后，通过离心（12,000 rpm，30 分钟）分离所得纳米颗粒，并用热水洗涤数次以去除杂质。将得到的 FePt@PPy NPs 用 PBS 超声 3 分钟重悬。

特征化

使用场发射透射电子显微镜（FETEM；JEM-2100F，JEOL，日本）观察纳米颗粒的形态。通过能量色散光谱（EDS）分析原子组成。使用傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 光谱仪 (Perkin Elmer 1320 FTIR 分光光度计) 分析纳米颗粒的化学官能团。使用电泳光散射分光光度计 (ELS-8000, OTSUKA Electronics Co. Ltd., Japan) 通过动态光散射法测定纳米颗粒直径。 UV-Vis-NIR光谱通过使用UV-Vis-NIR光谱(Thermo Biomate 5分光光度计)测量。使用功率可调的 808 nm 激光器（连续波，最大功率 =5 W，中国北京海泰光电有限公司）进行激光照射。

光热测试

为了测量所制备的 NPs 的光热性能，将含有特定浓度（20、30、50、70、100 和 120 μg/mL）的 FePt@PPy NPs 的悬浮液 (1 mL) 添加到 12 孔中盘子。然后，每个孔都用 808 纳米的激光以 1 瓦/厘米的功率密度进行曝光 ² 5 分钟。此外，还记录了在 808 nm 激光器的不同功率密度下照射的 FePt@PPy NPs 的温度升高。简而言之，50-μg/mL FePt@PPy NP 溶液被 NIR 激光以所需的 0.5、1 和 1.5 W/cm ² 的功率密度照射 6 分钟。温度由温度计（MASTECH，CA，USA）通过热纤维记录。

光稳定性测试

50-μg/mL FePt@PPy NPs 暴露在 808-nm 激光下，功率密度为 1 W/cm ² 直至达到最高温度，然后关闭激光使其回到室温。加热和冷却循环重复六次。记录辐照样品的紫外-可见光谱与辐照样品进行对比。

长期存储测试

120 μg/ml 浓度的水悬浮液 FePt@PPy NPs 在 4°C 下储存 30 天，以评估其长期储存的稳定性。为了进行比较，观察了第一天和最后一天的 UV-Vis 吸收光谱和 FePt@PPy NPs 的粒径。此外，将不同培养基（包括 DI、DMEM 培养基加 FBS 和 PBS）上的 FePt@PPy NPs 在 4°C 下储存 30 天，以评估制备的 FePt@PPy NPs 的稳定性。

FePt-PPy NPs 的细胞毒性分析

使用标准 MTT 测定 [15] 来量化细胞的细胞毒性。 MDA-MB-231 乳腺癌细胞被用作模型癌细胞来测试 FePt@PPy NPs 的生物相容性。 FePt NP 处理的癌细胞用作对照。 MDA-MB-231 细胞系在补充 10% FBS 和 1% 抗生素的 DMEM 培养基中在 37°C 和 5% CO 2 的潮湿气氛中培养。 MDA-MB-231 细胞以 1×10 ⁴ 的密度接种于 96 孔微孔板中 细胞/孔。 24 小时后，将含有不同浓度（0、20、30、50、70、100 和 120 μg/mL）的 FePt@PPy NPs（或 FePt NPs）的 DMEM 培养基加入细胞板中，将处理过的细胞加入然后孵育 48 小时。请注意，两种测试纳米粒子的 FePt 量相同，包括 FePt NPs 和 FePt-PPy NPs。接下来，将 100 μL MTT 以 0.5 mg/mL 溶解在 PBS 中添加到每个孔中，并将细胞板进一步孵育 4 小时。存在于活细胞线粒体中的脱氢酶将可溶性 MTT 转化为不溶性紫色甲臜。接下来，加入 100 μL DMSO 以溶解不溶性紫色甲臜。随后，使用平板读数分光光度计在 570 nm 处记录紫色甲臜的吸收，以量化细胞活力的百分比。

细胞摄取

普鲁士蓝染色用于检查 MDA-MB-231 细胞中 FePt@PPy NPs 的细胞摄取 [16]。细胞以 1×10 ⁵ 的密度接种 12 孔板中的细胞/mL，并孵育 24 小时。接下来，将 200-μg/mL FePt@PPy NP 添加到细胞板中并再孵育 24 小时。之后，将细胞用冷甲醛固定 15 分钟。然后，10% 亚铁氰化钾和 20% 盐酸水溶液 (50:50 v /v ) 加入细胞板并孵育 1 小时。用光学显微镜观察结果。

体外光热疗法

进行 MTT 测定以量化 FePt@PPy NPs 对 MDA-MB-231 乳腺癌细胞杀伤能力的功效。简而言之，MDA-MB-231 细胞在 96 孔微孔板中以 1×10 ⁴ 的密度培养 细胞/孔。第二天，将特定浓度（0、10、20、30、50、70 和 100 μg/mL）的 FePt@PPy NP 溶液加入细胞板中，将处理过的细胞再培养 24 小时.然后，使用 PBS 清洗未结合的纳米颗粒。随后，将微孔板暴露于功率密度为 1 W/cm ² 的 NIR 激光下 分别为 4 分钟和 6 分钟。为得到结果，按照“FePt-PPy NPs的细胞毒性试验”部分的细胞毒性试验进行了以下步骤。

Hoechst 33342 和 PI 的双重染色也用于检测由于使用 FePt@PPy NPs 进行光热处理而造成的损坏和死细胞。具体地，将MDA-MB-231细胞以1×10 ⁵ 的密度接种在12孔板中 细胞/孔。 24 小时后，将细胞用 FePt@PPy NP（0、50、70 和 100 μg/mL）处理，并在 37°C 下继续培养另外 24 小时。接下来，通过用 PBS 轻轻洗涤去除未结合的纳米颗粒。随后，将细胞板暴露于功率密度为 1 W/cm ² 的 NIR 激光下 6 分钟。接下来，将细胞培养板在培养箱中放置 24 小时，然后用 Hoechst 33342 和 PI 对照射过的细胞进行染色。请注意，将 1.5-mL Hoechst 33342 (10 μg/mL) 添加到细胞培养板中，然后在培养箱中保持 20 分钟。然后，将细胞用 3 次 PBS 洗涤以去除多余的染色剂。然后，将细胞用 1.5-mL PI (10 μg/mL) 连续染色并在室温下孵育 5 分钟。最后，再次用PBS洗涤细胞，荧光显微镜（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）捕获荧光图像。

动物实验

为了对 FePt@PPy NPs 的光热特性进行体内测试，向 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠皮下注射 100 μL 100 μg/mL FePt@PPy NPs 的 PBS。另一只未注射的裸鼠用作对照。然后，用 808 nm 激光以 1 W/cm ² 照射小鼠的注射区域 6 分钟。动物实验程序经浦京大学动物护理和使用委员会批准，并按照实验动物护理和使用指导原则进行。

体外光声成像

PAI 设置

在体模上进行 PAI 以评估 FePt@PPy NPs 的 PA 信号。我们小组开发了无创 PAI 系统，如先前研究中所述[17]。 PAI 设置的示意图如图 11 所示。采用嵌入脉冲 Nd-YAD Q 开关激光器（Surelite III，CA，USA）的光学系统。激光器设置为 808 nm 波长和 10 Hz 频率，脉冲操作为 5 ns。具有 50 毫米焦距的输入光纤（Thorlabs，Newton，NJ，USA）连接到平凸透镜。输出光纤连接到聚焦换能器（Olympus NDT，美国）并调整到照明区域的中心。为了记录 PA 信号，数据通过与激光系统集成的 DAQ（数据采集）系统进行数字化和存储。随后，通过LabVIEW程序将记录的数据用于重建体模的二维图像。

样品准备

PVA 体模用 8% PVA 制备以模拟组织。预接种的 MBA-MD-231 癌细胞用不同浓度的 FePt@PPy NPs（50、100 和 200 μg/mL）处理 24 小时，然后收获细胞并与 4% 的明胶混合在体模上（图 12a）。然后，用一小层 4% 的明胶覆盖该模型并使其凝固。最后将体模固定在水箱上进行PAI处理。

结果与讨论

FePt@PPy NPs 的合成和表征

FePt NPs 的合成过程如方案 1 所示。这些纳米粒子的 EDS 分析显示 Fe 和 Pt 的最终原子组成分别为 20% 和 80%（附加文件 1：图 S1）。疏水性 FePt NPs 用 3-MPA 修饰；因此，它们变成了平均尺寸为 8.3 nm 的亲水性 FePt NP。由于表面存在油酸和油胺，疏水性 FePt NPs 分散在己烷中。然而，粒子在配体交换后变得可溶于水。疏水性 FePt NPs 和亲水性 FePt NPs 的 FTIR 光谱揭示了来自表面上油酸、油胺和 3-MPA 吸收配体的特征带（图 3；方案 2）[14, 18]。 FTIR 数据（图 2）以及亲水性 FePt NPs 在水中的良好溶解性（方案 1，步骤 2）证实了成功的配体交换过程。

FePt@PPy NPs的合成及在光热治疗和光声成像中的应用示意图

使用 (NH4)S2O8 作为氧化剂和 PVA 作为稳定剂，通过化学氧化聚合用 PPy 包覆 FePt NPs。通过 TEM 成像清楚地观察到 PPy 层（图 1c），厚度约为 10 nm，FePt@PPy NPs 的平均尺寸为 42 nm（图 1d）。 FePt@PPy NPs 的 FTIR 也用于通过检查 FTIR 频率变化来确认 PPy NPs 的涂层（图 3c）。 PPy 的特征峰在之前的报告中得到了很好的分析[19]。 1620 和 1446 cm ⁻¹ 处的 FTIR 振动带 被分配到 PPy 环的 C-C 和 C=C 伸缩振动。 1236 cm ⁻¹ 处的波段 归因于 C-N 伸缩振动，以及 1076 cm ^-1 表明存在 C-N 面内变形模式。此外，798 和 600 cm ⁻¹ 处的带 分别归因于 C-H 和 N-H 面内变形振动和 C-H 外弯曲振动。 FTIR 与 TEM 一起确保了 PPy 外层 FePt NPs 的成功包覆。

一 TEM 和 b 纯 FePt NPs 的相应尺寸分布。 c TEM 和 d FePt@PPy NPs的相应尺寸分布

(a) 疏水性 FePt NPs、(b) 亲水性 FePt NPs 和 (c) FePt@PPy NPs 的 FTIR 光谱

纯 FePt、PPy 和 FePt@PPy NPs 的 UV-Vis-NIR 光谱

纯 FePt NPs 和 FePt@PPy NPs 的光热加热曲线与相同量的 FePt。所有溶液均用 1-W/cm ² 808 纳米激光 6 分钟

一 不同浓度 FePt@PPy NPs 的 UV-Vis-NIR 光谱。 b 不同浓度的 FePt@PPy NPs 的光热衰减。 c 辐照样品的相应 NIR 热成像图像。所有溶液均用 1-W/cm ² 808 纳米激光 5 分钟

一 50 μg/mL FePt@PPy NPs 在不同功率密度的 808 nm 激光下保持 6 分钟的光热行为。 b 在开/关激光实验 (1 W/cm ² ) 下，50 μg/mL FePt@PPy NPs 的六个加热/冷却循环的实时温度记录 ）。 c FePt@PPy NPs辐照前后的UV-Vis-NIR光谱

MDA-MB-231 细胞与不同浓度的 FePt 和 FePt@PPy NPs 孵育 48 小时后的细胞活力（使用 MTT 分析）

在不同激光功率密度和不同照射时间下，用 FePt@PPy NPs 处理的细胞存活的细胞百分比。 一 照射进行 4 分钟。 b 照射 6 分钟

MDA-MB-231 细胞在不同条件下的明场和荧光图像。 一 控制。 b 仅激光。 c 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 激光。 d 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 激光。 e 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 激光。所有溶液均以 1 W/cm ² 808 纳米激光 6 分钟

一 注射 FePt@PPy NPs 前裸鼠的光学图像和相应的 NIR 热成像图像。 b 左侧：皮下注射裸鼠的光学图像。红色虚线圆圈表示注射的位置。右侧：裸鼠在 808 nm 激光 (1 W/cm ² ) 照射下 6 分钟后的 NIR 热成像图像 ）。请注意，最大加热对应于注射部位。 c 注射部位皮肤表面的温度变化和小鼠在 808 nm 激光照射下的温度变化 (1 W/cm ² ) 6 分钟

PAI系统实验装置

FePt@PPy NPs在不同浓度下的PA响应评估：a 幻影和b 对应的PA图像

图 3 给出了纯 FePt、PPy 和 FePt@PPy NPs 的 UV-Vis-NIR 吸收光谱。观察到复合纳米粒子在 NIR 区域的强吸收。 FePt 和 PPy 的吸收光谱可能共同促成 FePt@PPy NPs 的吸收光谱。紫外-可见-近红外光谱还记录了不同浓度（20 至 120 μg/mL）的 FePt@PPy NP 水分散体的光学性质。如图4a所示，随着FePt@PPy NP浓度的增加，整个UV-Vis-NIR区域的光吸收强度增加。

FePt@PPy NPs 的光热性能

图 4 比较了纯 FePt 和 FePt@PPy NPs 的光热行为。具有固定 FePt 量的纯 FePt 和 FePt@PPy NPs 被 808 nm 激光以 1 W/cm ^{的功率密度照射2} .与纯 FePt NPs 相比，FePt@PPy NPs 表现出优异的光热行为。该数据表明PPy层增强了整个系统的光热效率。

如图所示。图 5a，在相同的 NIR 激光条件下（5 分钟，1 W/cm ² )，含有 20 μg/ml FePt@PPy NPs 的溶液的温度从 25°C 增加到 39.3°C，而含有 120 μg/ml FePt@PPy NPs 的溶液温度迅速达到 71°C。此外，热成像图像（图 5c）表明含有经 808 nm 激光照射的 FePt@PPy NP 的样品的光热有效转换。 FePt@PPy NPs (50 μg/mL) 暴露于 NIR 激光照射下，激光功率密度为 0.5、1.0 和 1.5 W/cm ² 6 分钟，所得温度分别为 41.1、51.3 和 59.4°C。这些实验结果表明，曝光时间、纳米粒子浓度和激光功率强度是显着影响FePt@PPy NPs光热性能的重要参数。

FePt@PPy NPs 的光热稳定性测试

除了强大的光热传导外，纳米粒子的光稳定性在 PTT 中也很重要。用 808 nm NIR 激光以 1.0 W/cm ² 照射 50 μg/mL 的 FePt@PPy NP 溶液 直到溶液达到最高温度，然后通过关闭激光自然冷却至室温。经过六个加热和冷却循环后，FePt@PPy NPs 的热曲线在每个循环中几乎保持不变（图 4d）。激光曝光前后的 UV-Vis-NIR 光谱如图 6c 所示。整个光谱没有观察到显着变化。上述结果表明，FePt@PPy NPs在长期近红外激光照射下具有良好的光热稳定性。

长期存储测试

在 30 天的储存期间监测制备的纳米颗粒的粒径和 UV-Vis-NIR 吸收光谱。首先，在所有含有 FePt@PPy NPs 的溶液中都没有观察到聚集（附加文件 1：图 S3a）。其次，细胞培养基中浓度为 120 μg/mL 的 FePt@PPy NP 在储存 30 天后其 UV-Vis-NIR 光谱（附加文件 1：图 S3b）没有显示任何显着变化。此外，FePt@PPy NPs 的平均粒径在长期储存期间几乎保持不变（附加文件 1：图 S3c）。以上结果均证明了所制备纳米颗粒的稳定性。

体外细胞毒性分析

对于癌症治疗，纳米粒子应具有优良的生物相容性。如图 7 所示，MDA-MB-231 乳腺癌细胞用不同浓度的纯 FePt 和 FePt@PPy NPs 处理并孵育 48 小时。即使在最高测试浓度（120 μg/mL）下，也未观察到 FePt@PPy NPs 的显着细胞毒性，并且 MDA-MB-231 乳腺癌细胞的细胞活力仍高于 95%。对于纯 FePt NP，120 μg/mL 辐照纳米粒子杀死了 20% 的癌细胞。该结果表明PPy层的包覆提高了FePt NPs的生物相容性，FePt@PPy NPs可以被认为是一种无毒材料。

细胞摄取

普鲁士蓝染色基于铁和亚铁氰化钾在酸性溶液中的反应，用于检测 FePt@PPy NPs 的细胞摄取。如附加文件 1：图 S2 所示，大部分细胞在细胞内被蓝色染色，表明细胞摄取了 FePt@PPy NPs。

体外光热疗法

进行标准 MTT 测定以评估经照射的 FePt@PPy NPs 对 MDA-MB-231 乳腺癌细胞的杀伤能力的功效。首先，癌细胞与不同浓度的 FePt@PPy NPs 孵育 24 小时，然后暴露于 1 W/cm ² 的 808 nm 激光 4 分钟。如图 8 所示，当处理的纳米颗粒浓度增加时，细胞活力的百分比逐渐降低。大约 50% 的细胞在 100 μg/mL 浓度的辐照 FePt@PPy NP 下死亡。为了杀死更多的癌细胞，照射时间增加到 6 分钟。在 100 μg/mL 浓度下，观察到大约 70% 的死细胞。 A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.

Conclusions

In this study, we developed the photoabsorber FePt@PPy NPs and evaluated their efficiency on in vitro PTT and PAI (Scheme 2). The prepared FePt@PPy NPs showed many good properties for PTT and PAI including excellent biocompatibility, photothermal stability, and high NIR absorbance. Moreover, in vitro investigation confirmed the effectiveness of the FePt@PPy NPs in killing the cancer cells under the NIR laser. So far, the phantom test of PAI used in conjunction with FePt@PPy NPs showed a strong PA signal. Owing to their good properties, the novel FePt@PPy NPs could be considered as promising multifunctional nanoparticles for further applications in PTT and PAI.