PDMAEMA 基含银共聚物胶束的简便原位制备和体外抗菌活性

介绍

在过去的几十年中，一系列传统的抗微生物药物已被广泛用于治疗传染病。据世界卫生组织统计，多重耐药微生物的快速出现已成为日益严重的全球性问题，在人类健康的主要威胁名单中位列前三位[1,2,3,4,5]。因此，需要开发安全性好、抗菌能力强且不产生细菌耐药性的新型抗菌药物。银纳米粒子 (AgNPs) 作为自古以来最好的抗菌剂之一，因其对各种细菌和真菌病原体的优异性能、对哺乳动物细胞的毒性相对较低以及细菌耐药性有限而被广泛应用于消费品中 [6,7, 8,9,10]。 AgNPs能够提高细菌的膜通透性，渗透到细胞质中，使细菌蛋白质变性，破坏细菌的复制，导致细菌死亡[11,12,13]。大量银制剂已被用于阐明 AgNPs 的抗菌活性 [14,15,16,17]，例如，通过两性离子聚羧基甜菜碱水凝胶的伤口敷料以及作为核心成分的抗菌 AgNPs 由 Zhang 等人提出<我>. [18]，Moreno-Couranjou等人提出的通过多组分涂层共固定AgNPs获得的多功能表面[19].

然而，大比表面积和高表面能导致AgNPs的聚集，这已成为其应用的一大瓶颈。因此，需要聚合物基质或外部稳定剂来稳定 AgNPs。众所周知，聚合物基体是解决聚集问题最常用的方法。目前，聚合物基体稳定AgNPs的方法有化学还原法、电化学法、光化学法和微波法等。其中，化学还原是一种常用而有效的方法。通过在溶液中加入诸如水合肼 (N2H4)、硼氢化钠 (NaBH4)、柠檬酸钠和抗坏血酸等还原剂，将硝酸银还原为 AgNPs [20,21,22,23]。例如，Hoda 等人。聚苯乙烯嵌段聚丙烯酸 (PS-b -PAA) 在还原剂 N2H4 的影响下装载 20 nm AgNPs 的反胶束，PS 块在甲苯中起到外层作用 [24]。 Liu课题组报道，自组装胶束纳米模板是由聚（ε-己内酯）-嵌段-聚（天冬氨酸）（PCL-b -PAsp)。以 AgNO3 为前体，NaBH4 为还原剂制备分散良好的 AgNPs [25]。然而，上述方法不环保，且还原剂的添加过多会产生副产物，导致AgNPs的纯化困难，限制了其在传染病抗菌药物中的应用。

同时，据报道，含有胺基的聚合物可用作还原剂和稳定剂，以原位制备 AgNPs。例如，Lang 等人。合成了由 PCL、2-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯（DMAEMA）和聚（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯（PEGMA）组成的六臂星形聚合物。该系统直接将硝酸银还原为 AgNPs，而无需在水相中添加任何其他还原剂 [26]。尽管上述 AgNPs 在没有额外还原剂的情况下表现出容易的表面改性，但相对于金纳米粒子 [27, 28]，聚合物拓扑结构对银纳米粒子的还原和稳定性的影响以及它们在基于胶束的抗菌活性中的应用较小学习了。

在这项工作中，设计了一种温和、简便和绿色的方法来对抗细菌感染，利用由线性或四臂星形三嵌段共聚物自组装而成的聚合物胶束，其分子量和聚合度与纳米平台相似装饰 AgNPs（方案 1）。在这种方法中，由 DMAEMA、甲基丙烯酸 2-羟乙酯 (HEMA) 和 PEGMA 组成的三嵌段共聚物可以在水性条件下生成自组装胶束，这是制备和稳定 AgNPs 的良好模板。带有叔胺基团的 PDMAEMA 嵌段可以很容易地吸收 Ag ⁺ 离子通过配位相互作用，然后原位生成 AgNPs，无需任何还原剂。具有高亲水性的 HEMA 和 PEGMA 嵌段可用作水相中的稳定剂，以进一步提高 AgNPs 的稳定性。因此，硝酸银可以自发地在自组装共聚物胶束的核上配位和脱氧，形成 AgNPs。它们嵌入胶束核中，可能导致细菌膜的破坏。在这里，线性或四臂星形共聚物拓扑如何影响 AgNPs 的最大吸收波长、形态、粒径、zeta 电位、稳定性以及抗菌效率。因此，对其结构与性能关系的研究，或许可以为银杂化纳米粒子治疗细菌感染提供更深入的解释。为制备结构更稳定、粒径可控的AgNPs提供设计思路和技术基础。

形成线性/星形共聚物胶束稳定AgNPs具有优异抗菌活性的示意图

材料和方法

材料

季戊四醇 (J&K Scientific Ltd.) 在使用前通过减压干燥 24 小时。 2-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯（DMAEMA，> 98%）、甲基丙烯酸2-羟乙酯（HEMA，99%）和聚（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯（PEGMA，M n =300 Da, 99%)，均来自 Aldrich，通过通过含有中性氧化铝的柱子去除抑制剂进行纯化。使用氢化钙 (CaH2)，将来自 Aldrich 的四氢呋喃 (THF) 和甲苯干燥，然后在使用前减压蒸馏。 2-溴异丁酸乙酯 (EBiB, 98%, Alfa Aesar), 2-溴异丁酰溴 (BIBB, 98%, Alfa Aesar), 1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺 (HMTETA, 99%), 硝酸银(AgNO3, 99.9%)、溴化铜 (CuBr2)、甲醇、三乙胺 (TEA)、二氯甲烷 (DCM)、丙酮、n -己烷、二甲亚砜 (DMSO)、辛酸亚锡 (Sn(Oct)2)、碳酸钠 (Na2CO3)、碳酸氢钠 (NaHCO3)、氯化钠 (NaCl)、硫酸钠 (Na2SO4) 以及所有其他从 J&K 化学公司按原样使用。

一般表征和检测

质子核磁共振 ( ¹ 在 25 °C 下通过 Bruker ADVANCE 400 MHz 光谱仪（麦迪逊，威斯康星州，美国）在 CDCl3 和 D2O 中检测线性或四臂三嵌段共聚物的 H NMR）光谱。线性共聚物、星形共聚物及其胶束稳定的 AgNPs 的傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 光谱测量是使用 FT IR 分光光度计 (Nicolet Nexus for Euro, USA) 进行的，该分光光度计在 25 °C 下具有透射模式。在用溴化钾 (KBr) 研磨然后压缩后制备颗粒样品。为了获得光谱，预先设定光谱条件，波长为4000至400 cm ^-1 （32 次扫描）和 8 cm ⁻¹ 的分辨率 .使用 Malvern Zetasizer Nano S 仪器（Malvern，WR，UK）进行电泳测量，测量了不同摩尔比的线性和星形共聚物胶束稳定的 AgNPs 的 zeta 电位，其中每个样品在 25°C 下测试 3 次。进行了在 200 kV 下运行的透射电子显微镜（TEM，FEI Tecnai-G20）以观察线性和星形共聚物胶束在不同摩尔比下稳定的 AgNPs 的形态。 TEM产品的制备过程如下：首先将10μL样品溶液滴在涂有碳的铜网上，然后在空气中干燥。使用紫外-可见分光光度计（UV-2450，Shimadzu，Kyoto，Japan）测定不同摩尔比下线性和星形共聚物胶束稳定的 AgNP 的紫外-可见光谱。热重分析 (TGA) 在 NETZSCH (STA409PC, Germany) 设备上进行。将所有干燥的粉末样品（线性共聚物、星形共聚物及其胶束稳定的 AgNPs）在氮气条件下以 10 °C /min 的速率从 25 °C 加热至 600 °C。

PDMAEMA-b的合成 -PHEMA-b -PPEGMA

通过 DMAEMA、HEMA 和 PEGMA 的电子转移原子转移自由基聚合（AGERT ATRP）再生的连续活化剂按照 Zhang 等人修改的程序进行。 [29, 30]。简而言之，加入CuBr2（10mg，0.045mmol）后，将100mL干燥的三颈烧瓶抽真空并用氩气冲洗3次。在脱气注射器的辅助下，将无水甲苯（25 mL）、EBiB（88 μL，0.24 mmol）、DMAEMA（5.15 mL，30.5 mmol）和配体HMTETA（62 μL，0.24 mmol）依次注入容器中，随后10 分钟搅拌。将 Sn(Oct)2 (78 μL, 0.24 mmol) 与甲苯 (2 mL) 溶液一起注入后，反应在 70 °C 油浴中进行 8 小时。在溶液变得更稠后，连续的封闭 HEMA (2.32 mL, 18.4 mmol) 被注入用于接下来的 8 小时反应。最后，在第三个单体 PEGMA（8.89 g，55.6 mmol）的参与下，我们见证了 72 小时的连续反应，然后将烧瓶冷却至接近室温。将THF(30mL)注入容器中，然后使反应混合物通过中性氧化铝柱以除去催化剂。产品 PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA 沉淀成十倍过量的冷 n -己烷，过滤，最后在35°C真空干燥48小时。

(PDMAEMA-b 的合成 -PHEMA-b -PPEGMA)4

星型溴封端引发剂 (Br)4 是通过季戊四醇上的末端羟基与 2-溴异丁酰溴酯化合成的，使用 THF 作为溶剂，TEA 作为酸结合剂。通常，在加入季戊四醇 (2.72 g, 2 mmol) 后，将 100 mL 三颈烧瓶抽真空并用氩气冲洗 3 次，然后依次滴入无水 THF (120 mL) 和 TEA (12.51 mL, 90 mmol) .在冰/水环境下，将 2-溴异丁酰溴 (11.12 mL, 90 mmol) 逐滴注入剧烈搅拌的溶液中，然后在 0 °C 下反应 4 小时，然后在 25 °C 下反应 20 小时。为了纯化产物，混合物首先通过中性氧化铝柱。粗产物依次用水、10% Na2CO3、饱和NaHCO3和饱和NaCl洗涤，然后依次用Na2SO4干燥过夜，过滤并浓缩，然后倒入十倍过量的冷n -己烷沉淀产物，最后真空干燥24h得到产物。

(PDMAEMA-b的合成路线和投料量 -PHEMA-b -PPEGMA)4 使用与 PDMAEMA-b 相同的程序进行 -PHEMA-b -PPEGMA。

使用线性或星形共聚物胶束制备 AgNPs

PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA 或 (PDMAEMA-b -PHEMA-b 首先得到-PPEGMA)4水溶液(pH 7.0)，向其中加入AgNO3溶液，同时引发DMAEMA与Ag ⁺ 的还原反应 在胶束核中原位形成AgNPs。以DMAEMA与AgNO3的摩尔比等于9为例，首先，PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA 或 (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 与相同量的 [DMAEMA] =4.8 mM 在丙酮 (5 mL) 中搅拌 4 小时，然后在搅拌下加入蒸馏水 (20 mL) 过夜以形成稳定的胶束。然后将 AgNO3 溶液（220 μL，48 mM）逐滴注入上述溶液中，并在 25°C 下黑暗中搅拌 48 小时。最后，通过收集和冷冻干燥制备线性或星形聚合物胶束稳定的AgNPs，然后储存在- 20°C用于后续实验。

抗菌检测

聚合物胶束稳定的AgNPs对大肠杆菌的抗菌研究 DH5alpha (E . 大肠杆菌 DH5α) 菌株使用 Luria-Bertani (LB) 培养基作为载体，通过超声波制备不同浓度的聚合物胶束稳定的 AgNPs 溶液。单克隆E . 大肠杆菌 DH5α 在 LB 培养基 (5 mL) 中于 37°C 下在振荡器上以 200 rpm 的速度培养过夜，然后将细菌悬液稀释至 1 × 10 ⁵ LB 培养基的 CFU/mL。在将等体积的稀释细菌与不同浓度的共聚物胶束或胶束稳定的 AgNPs 混合并在 37°C 下孵育 16 小时后，通过酶标仪（Multiskan Spectrum， Thermo Scientific，芬兰万塔）。每个实验重复六次。

细胞活力评估

为了评估细胞活力，对肝细胞癌 (HepG2) 细胞进行了 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 测定。在细胞接种之前，HepG2 细胞首先在 5% CO2 的湿润气氛中于 37°C 下在补充有 10% 胎牛血清 (FBS)、青霉素 (100 μL/mL) 和链霉素 (0.1 毫克/毫升)。然后，将 HepG2 细胞以 1 × 10 ⁴ 的密度接种于 96 孔板上的新鲜 DMEM 培养基中 每孔培养1天。用预先制备的共聚物胶束或胶束稳定的AgNPs溶液（100 μL）替换不同浓度的DMEM培养基后，细胞继续培养24小时。用 PBS 缓冲液洗涤三次后，加入 20 μL MTT 试剂（5 mg/mL）和 180 μL 新鲜 DMEM，再孵育 4 小时。最后，将溶液改为 200 μL DMSO，轻轻摇动板 10 分钟。用上述酶标仪测量 570 nm 处的吸光度。 6次平行实验数据取平均值。

耗散粒子动力学模拟

为了分析 AgNPs 的生长过程，使用 Materials Studio 8.0 (Accelrys Inc., San Diego, CA,美国）。如附加文件1：图S1所示，六种珠子构成了共聚物PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA 或 (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4：橙色代表中心，浅绿色代表 MAA1（靠近乙胺侧链的甲基丙烯酸酯），绿色代表 DMA（氨基乙基侧链），粉色代表 HEMA，浅蓝色代表 MAA2（靠近 PEG 侧链的甲基丙烯酸酯） , 蓝色为 PEG。具有晶胞晶体的小簇（晶格长度：3.87 Å）由四个银原子组成，标记为银珠（金色）。同时，每颗黑色水珠（W）都含有五个水分子。根据我们之前的工作，附加文件 1：表 S1 显示了计算交互参数的结果 [31, 32]。一个 30 × 30 × 30 r c ³ 全方位使用具有周期性边界条件的三次仿真框，总仿真步长为100,000，积分时间步长为0.05 ns。

统计分析

使用两样本学生的 t 进行统计分析 不等方差检验。 p <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

线性/星形共聚物的合成和表征

线性共聚物 PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA 和星形共聚物 (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 是通过 DMAEMA、HEMA 和 PEGMA 的 ARGET ATRP 聚合合成的，CuBr2/HMTETA 作为催化剂，Sn(Oct)2 作为还原剂，EBiB 或季戊四醇之前用 BIBB 作为引发剂在甲苯中酰化（方案 2） ）。通过 ¹ 验证了目标聚合物的结构和组成 核磁共振。 PDMAEMA-b自组装聚合物胶束 -PHEMA-b -PPEGMA 或 (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 以 DMAEMA 作为功能块，其中 Ag ⁺ 在没有额外还原剂参与的情况下，离子被吸引并还原成 AgNPs。从理化性质、抗菌和抗癌活性等方面讨论和评价共聚物拓扑结构对AgNPs的影响。

a的合成路线 PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA 和 b (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4

¹ 确定了线性/星形共聚物的化学结构 核磁共振。首先，季戊四醇的末端羟基完全转移到末端溴基（Br）4上，如图 ¹ H NMR 光谱（附加文件 1：图 S2）。 4.33 ppm 处的峰归因于 -CH 2O- 在季戊四醇中，而新的 -(CH 3)2-出现在 1.94 ppm 的信号。并且在 1.94 ppm 到 4.33 ppm 处峰的积分比值约为 3。如附加文件 1：图 S3 和 S4 所示，-C(CH 3)2-出现在1.94 ppm。 1.83 ppm、1.00 ppm 处的信号分配给 -CH 2- 和 -CCH 3-分别位于甲基丙烯酸甲酯的主链中。 2.58 ppm和4.08 ppm处的峰属于相邻的两个亚甲基质子-CH的特征共振 2CH 2- 在 DMAEMA 块中，2.29 ppm 处的峰归属于甲基质子 -CH 3-，它与叔胺基团相连。 -CH 的存在 2 CH 2 - 连接到 HEMA 单元中末端羟基的亚甲基质子分别出现在 4.08 ppm 和 3.57 ppm 处。 -OCH的特征PEG峰 2CH 2- 和终端 -CH 3 个质子分别出现在 3.67 和 3.39 ppm 处。 ¹ 中5.5-6.1 ppm处的双键峰消失 H 核磁共振谱。从信号 (f) 到 (a) (I f/我 a), 信号 (g) 到 (a) (I g/我 a) 和信号 (h) 到 (a) (I h/我 a) 分别为 PDMAEMA19.3-b -PHEMA12.5-b -PPEGMA24.6 和 (PDMAEMA5.0-b -PHEMA5.6-b -PPEGMA5.0)4。

线性/星形共聚物胶束稳定的 AgNPs 的制备和表征

AgNPs的形成过程如Scheme 1所示。 N原子上的孤对电子属于PDMAEMA分子链中的叔胺基团，具有配位和还原能力，因此既可以用作捕获剂和还原剂。首先，由于 Ag ⁺ 之间的络合，银离子被 PDMAEMA 捕获 和 N 原子，形成 (Ag ⁺ )-PDMAEMA 复合物。随后，Ag ⁺ 在成核阶段原位还原形成银原子。之后，随着银晶体的生长，银的成核继续，导致银纳米颗粒的形成[26]。亲水嵌段 PPEGMA 作为胶束壳，提供了稳定的保护层，进一步提高了 AgNPs 的稳定性。自组装胶束在体系内的空间稳定作用由胶束对 AgNPs 稳定性和 AgNPs 之间团聚的热力学平衡决定。在少量 AgNPs 的情况下, 共聚物的空间稳定性可以防止 AgNPs 的进一步聚集。随着Ag数量的增加，胶束对AgNPs的稳定性会减弱，颗粒之间碰撞的可能性会增加，导致AgNPs的尺寸增长。利用胶束的空间稳定性，我们制备的AgNPs具有可控的粒径，具有很大的抗菌应用潜力。

进行DPD模拟研究AgNPs的生长过程和分布，在相同浓度的实际实验中（PDMAEMA/AgNO3摩尔比=1/1，线性共聚物、Ag和水珠的体积分数分别为10%、0.23%、和 89.77%）。图 1 揭示了 PDMAEMA-b 的珠子 -PHEMA-b -PPEGMA 和 AgNPs 最初在水溶液中呈不规则分布状态。随着时间的推移，最终形成了八个自组装共聚物胶束并均匀分散，而所有的银珠都被装入胶束中。可以看出，处于平衡状态的AgNPs可以稳定在共聚物胶束中而不会进一步聚集，表明自组装胶束能够阻止AgNPs的进一步聚集，进而达到控制其粒径和分布的目的。

PDMAEMA-b对AgNPs生长过程和分布的DPD模拟 -PHEMA-b -PPEGMA 在不同模拟时间的 PDMAEMA/AgNO3 摩尔比 =1/1。 一 为了清晰起见，水分子被隐藏起来。 b 只显示了 AgNPs

线性/星形共聚物及其胶束稳定的 AgNP 的 FT IR 表征显示在附加文件 1：图 S5 中。显然，与简单的线性/星形共聚物相比，1730 cm处的-COOR伸缩振动 ^-1 以及 PDMAEMA 中 C-N 键在 1457 cm ^-1 处的弯曲振动 AgNPs 形成后降低，表明 AgNPs 已成功加载到共聚物胶束上。 X 射线衍射光谱证实了线性/星形共聚物胶束稳定的 AgNP 的结晶性质（附加文件 1：图 S6）。 38.5°、44.8°、64.2°和78.0°的衍射峰值对应于面心立方（fcc）晶体结构的（111）、（200）、（220）和（311）晶面含银纳米粒子 [33, 34]。测量了线性/星形共聚物胶束稳定的 AgNPs 的 zeta 电位。如图 2 所示，这些共聚物胶束稳定的 AgNP 的 zeta 电位约为 15.0-23.2 mV。此外，随着 AgNO3 用量的增加，胶束稳定化 AgNPs 的 zeta 电位显着增加，因为更多的 AgNPs 被修饰。为了进一步研究 AgNPs 的分散和胶束对 AgNPs 的稳定作用，进行了线性/星形共聚物胶束在不同 PDMAEMA/AgNO3 摩尔比下稳定 AgNPs 的 DPD 模拟。如图2所示，结果还表明AgNPs的尺寸与聚集的小AgNPs数量增加和它们之间的距离减少的比例成正比，导致碰撞和团聚的可能性增加。

a 的 zeta 电位和截面图 线性和b 星形共聚物胶束稳定了 AgNPs。数据是在(a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1的不同PDMAEMA/AgNO3摩尔比下收集的

四种线性共聚物胶束稳定的 AgNPs 的光谱在位于 437 nm 附近的最大吸收峰具有微小差异，这是球形/近球形 AgNPs 的特征表面等离子体共振 (SPR) 吸收峰，与共振激发和带间跃迁有关他们（图3a）。结果证明线性共聚物中的叔胺基团可以与硝酸银反应，AgNPs的形成几乎不依赖于线性共聚物胶束的空间位阻。随后，在相同条件下具有相似嵌段和聚合度的星形共聚物，随着 PDMAEMA/AgNO3 摩尔比的增加，AgNPs 的粒径减小。由于叔胺上配位还原形成的 AgNPs 数量不同，紫外-可见光谱的低色移反映了其最大吸收峰分别位于 429 nm、426 nm、421 nm 和 414 nm星形共聚物胶束（图 3b）。换句话说，星形共聚物的空间稳定性可以更好地稳定 AgNPs 并防止其在少量 AgNPs 下进一步聚集。相反，AgNPs数量的增加削弱了稳定作用，这为AgNPs的碰撞提供了更多的机会，最终导致了更大的AgNPs。比较图 3a 和图 3b，线性共聚物胶束中的 AgNPs 在 437 nm 处的吸收峰具有更宽的波长分布，而星形共聚物胶束中的 AgNPs 在 422 nm 附近。在此，线性共聚物的光谱没有出现蓝移，这可以解释为线性共聚物胶束的嵌段对AgNPs的空间位阻影响较弱，从而增加了它们之间碰撞团聚的可能性。银纳米粒子。

a 的紫外-可见光谱 线性和b 星形共聚物胶束在(a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1的不同PDMAEMA/AgNO3摩尔比下稳定AgNPs

然后进行 TEM 测量以确定 AgNPs 的尺寸、尺寸分布和形态。 AgNPs 的 TEM 图像取决于 AgNO3 进料比如图 4 所示。当 PDMAEMA/AgNO3 摩尔比为 6 和 1 时，使用 ImageJ 软件计算，线性共聚物胶束稳定的 AgNPs 的粒径分别为 11.1 nm 和 25.7 nm，而星形共聚物胶束稳定的 AgNPs 的直径分别为 3.7 nm 和 6.4 nm。 AgNO3 含量的增加导致胶束中更多的银原子、更高的表面能，并且聚集的 AgNPs 的数量随着 AgNPs 尺寸的增大而相应增加。很明显，胶束稳定的 AgNPs 是单分散的和球形的，线性共聚物胶束稳定的 AgNPs 有点不均匀。胶束稳定的AgNPs的大小进一步补充了UV-Vis结果。

a 的 TEM 图像 , b 线性共聚物和c , d 星形共聚物胶束在不同的 PDMAEMA/AgNO3 摩尔比下稳定了 AgNPs：a , c 6/1，b , d 1/1

线性/星形共聚物胶束稳定的 AgNPs 的稳定性

线性/星形共聚物胶束稳定的AgNPs的稳定性对生物医学领域的发展具有重要影响。显然，星形共聚物胶束稳定的 AgNPs 的 UV-Vis 光谱（图 5）中的 SPR 峰即使在进一步稀释 1 倍、3 倍和 6 倍后，至少在 1 个月内也没有显示出任何显着变化，表明制备的 AgNPs 在实验浓度范围内表现出良好的长期胶体稳定性。 However, the results of linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed that the UV absorption wavelength decreased slightly as the increase of dilution ratios. And the micelles concentration of linear copolymer decreased after 1 month of placement may lead to insufficient provision of steric hindrances to stabilize AgNPs.

UV-Vis spectra of a linear copolymers and b star copolymers micelles stabilized AgNPs solution at PDMAEMA/AgNO3 molar ratio =6/1 after 1 month at the diluted times of 1 (a), 3 (b), and 6 (c), respectively

From the thermogravimetric analysis curves in Fig. 6, it was shown that the initial decomposition temperature (T onset) of linear copolymers micelles was 217 °C, which shifted to 172 °C after silver loading, suggesting that the linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed lower thermal stability than the pure linear copolymers micelles. It may be due to the fact that the chemical structure of PDMAEMA in the molecular chain changes and the catalytic effect of AgNPs in the thermal degradation process cannot be ignored [35]. As for star copolymers and their stabilized AgNPs, T onset were around 213 °C. The two Tonset of star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs showed very few gaps, which could be speculated that the more stable star-shaped copolymers have better effect on stabilizing AgNPs than the linear copolymers. Combined the results of UV-Vis, TEM, and TGA measurements, it could be inferred that compared to the linear copolymers, the star copolymers have superior advantages in topology for stabilizing AgNPs, such as better stability, more uniform dispersion, slower nucleation rate during reduction, and the better product with a smaller and more uniform size of AgNPs.

TGA curves of a linear copolymers and b star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO3 molar ratio =6/1

Antibacterial Activity and Cell Viability

To evaluate the antibacterial activities of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs by optical density (OD600) measurements, E . coli DH5α was selected as the Gram-negative bacterial model. The absorbance at 600 nm after incubation was tested by incubating the bacteria with the eight different concentrations of micelles and micelles stabilized AgNPs at 37 °C. Results shown in Fig. 7a illustrated that the bacterial growth curves were highly correlated with the AgNPs concentration in the LB medium. The inhibition of linear/star copolymers micelles on the growth of bacteria was weak, which was not fatal to bacteria. However, as the concentration of linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs increased, the survival rate of E . coli DH5α was significantly inhibited, indicating a strong antibacterial efficacy of AgNPs against E . coli DH5α. The concentrations of linear copolymers micelles stabilized AgNPs preventing the bacterial growth in the experiments were relatively higher than those of star copolymers micelles stabilized AgNPs, which might due to the fact that bigger size of AgNPs could lead to a lower antibacterial performance because of the inefficient exposure of bacteria to AgNPs and relatively slow release behavior of AgNPs.

一 Antibacterial activity and b cell viability of linear copolymers and star copolymers micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO3 molar ratio =6/1. *p <0.05, two-tailed Student t 测试

Cancer is an uncontrollable disease of cell growth that can occur in any part of the body. The most common cancers are liver cancer, breast cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Among them, the liver cancer has the much higher prevalence in both developed and developing countries. Therefore, the toxicity experiments of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs on HepG2 cells were carried out, in which HepG2 cells were incubated with linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs at different concentrations (10, 50, 100, 200, 400 mg/L, respectively) for 48 h and the cell viability with MTT assay was the most intuitive data to evaluate the biocompatibility of the composite material. As shown in Fig. 7b, the percentage of viable cells for the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited negligible cytotoxicity, and was about 90% viability even at the highest concentration applied (400 μg/mL) after 48-h incubation, indicating the advantageous cytocompatibility of the micelles stabilized AgNPs within a relatively wide range of concentration.

Conclusion

In conclusion, PDMAEMA-based linear and star copolymer micelles as effective delivery carriers for silver-bearing antimicrobials were developed, and their in vitro antimicrobial efficacy and cell viability were investigated. Being a reducing agent and a stabilizer simultaneously, the micellar PDMAEMA core acted as loading platform for AgNPs in situ translated from the precursor silver nitrate. In silico simulation and experimental results indicated that both types of the copolymer micelles could generate monodisperse and spherical AgNPs. Compared with linear copolymers sliver-bearing micelles, the fabricated star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited smaller average size, better stability against dilution and pyrogenic decomposition, and enhanced antibacterial activities against E . coli DH5α due to the serious damage of bacterial membrane caused by loaded AgNPs. Moreover, both types of copolymer micelles stabilized AgNPs possessed great cytocompatibility toward HepG2 cells. Therefore, these studies may provide some guidance for the construction of more effective AgNPs weapon with well-defined and feasible polymer topology for combating the multiple bacteria-induced infections.

数据和材料的可用性

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求向相应作者索取。

缩写

AgNPs:

银纳米粒子

DMAEMA:

2-(dimethylamino) ethyl methacrylate

HEMA:

2-hydroxyethyl methacrylate

PEGMA:

Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate

CuBr2 :

Cupric bromide

¹ H NMR:

Proton nuclear magnetic resonance

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

KBr：

溴化钾

UV-Vis:

紫外可见

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑

HepG2:

Liver hepatocellular carcinoma

DPD:

Dissipative particle dynamics

SPR：

表面等离子体共振

XRD：

X射线衍射