亿迅智能制造网
工业4.0先进制造技术信息网站!
首页 | 制造技术 | 制造设备 | 工业物联网 | 工业材料 | 设备保养维修 | 工业编程 |
home  MfgRobots >> 亿迅智能制造网 >  >> Industrial materials >> 纳米材料

用于靶向 siRNA 递送的氧化还原敏感明胶/二氧化硅-适体纳米凝胶

摘要

由于其高特异性和抑制靶基因表达的能力,RNA 干扰 (RNAi) 具有优于其他基因治疗方法的潜在优势。然而,siRNA 的稳定性和组织特异性递送仍然是 RNAi 治疗的最大障碍。在这里,我们通过将基于明胶的纳米凝胶与靶向核仁蛋白的 AS1411 适体和脱氧核苷酸取代的 siRNA(Apt-GS/siRNA)通过二硫键连接在一起来实现 siRNA 的瞬时对接,从而开发了这样一个系统。由于二硫键裂解,这些 Apt-GS/siRNA 纳米凝胶在还原条件下表现出有利的 siRNA 释放。此外,该智能系统可以通过谷胱甘肽触发的分解和随后的荧光素酶高效 RNAi 选择性地将 siRNA 释放到核仁蛋白阳性细胞 (A549) 的细胞质中。此外,配备二硫化物的 Apt-GS 纳米凝胶在体外表现出良好的生物相容性。总之,这种氧化还原反应性、靶向肿瘤的智能纳米凝胶在开发功能化siRNA递送和肿瘤治疗方面显示出巨大的潜力。

介绍

RNA 干扰 (RNAi) 是基因的序列特异性沉默,由于其高特异性和低毒性,目前也被评估为治疗包括遗传疾病、癌症和传染病在内的多种疾病的最有前途的方法。 [1]。具有双链 RNA 分子的小干扰 RNA (siRNA) 比反义寡核苷酸更能抵抗核酸酶降解,因此显示出优于反义治疗的优势。将化学修饰的核苷酸掺入 siRNA 用于增加或减少 RNAi 的功效和持续时间。已经证明用脱氧核苷酸代替有义链的核糖核苷酸可以增加有义链的稳定性并保持~ 40%的RNAi效率[2, 3]。然而,尽管在体外研究中观察到了强大的基因敲低能力,但siRNA的组织特异性递送仍然是其应用的一大障碍[4, 5]。

基于纳米粒子的递送在有效稳定 siRNA 和进一步修饰位点特异性递送方面具有潜在优势 [6,7,8]。 siRNA 的高效定点递送可以增强转染并减少脱靶效应,这是大多数实际应用所必需的 [9]。核仁蛋白与多种生物过程有关,并在各种正常细胞的细胞核和细胞质中广泛表达。此外,与正常对应物相比,核仁素在活跃增殖的癌细胞的质膜上高度表达,因此被用作抗肿瘤治疗的有吸引力的靶标。适体AS1411(也称为AGRO100)是一种G-四重体DNA适体,通过与核因子-kB必需调节剂结合,能与细胞表面核仁蛋白强结合,阻断癌细胞的抗凋亡通路,已进入II期临床试验。第一种用于治疗人类癌症的核酸适体药物 [10, 11]。迄今为止,AS1411 已成功与各种纳米粒子结合并将它们内化到癌细胞中 [12,13,14,15]。明胶因其优异的生物相容性、生物降解性和胶凝特性而被用于 siRNA 封装 [16,17,18]。我们课题组探索了一系列可控尺寸和表面电荷的硅氧烷交联明胶纳米凝胶(GS NGs),证明了GS NGs在体外和体内的转染效率[19, 20]。

除了细胞内屏障外,内化后的细胞内屏障包括 siRNA 的有效分解和内体逃逸同样具有挑战性。通过不稳定或不稳定的键将 siRNA 与载体结合是克服这一交付挑战的有前途的方法。在酸性 pH 值和氧化还原电位下的刺激响应释放受到了极大的兴趣。由于细胞外环境中较高的谷胱甘肽 (GSH) 水平,二硫化物交联在通过肿瘤细胞中的裂解键释放药物的爆发中显示出巨大的潜力 [21, 22]。据报道,通过二硫键形成的聚(乳酸 - 共 - 乙醇酸)(PLGA)/siRNA缀合物表现出增强的封装和递送效率[23]。

在这项工作中,基于 GS 的混合纳米凝胶具有二硫键结合的氧化还原反应性和适体 AS1411 的特异性肿瘤靶向双重功能,被探索作为癌症治疗的 siRNA 载体(方案 1)。我们的目标是研究 AS1411 功能性 GS NG 是否会改善有效的细胞内化并在体外实现荧光素酶模型基因的肿瘤特异性基因沉默。此外,还对该系统的安全性进行了体外评价。

<图片>

开发了一种氧化还原响应性和靶向肿瘤的 Apt-GS NGs,用于通过二硫键结合和适体 AS1411 传递 siRNA

方法

材料

明胶(开花数:240-270,pH 4.5-5.5)购自 BBI Company Inc.(美国)。 N 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、3-缩水甘油氧基丙基-三甲氧基硅烷(GPSM)和3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)购自Sigma-Aldrich Co.(美国)。 3-(4, 5-Dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 购自 Amresco Co. (USA)。 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)、胎牛血清、青霉素和链霉素购自 Hyclone Co. (USA)。 AS1411 适配体、5'-FAM 标记的 AS1411 和阴性对照 DNA (TDO) 由 Sangon Biotech Co. (China) 合成。 Luc-siRNA 的硫醇有义链、5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'(脱氧核苷酸替代核糖核苷酸)和反义链、3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5',以及 FAM 标记的反义链3'末端的链由Gene Pharma Co.(中国)合成并用HPLC纯化。 Lipofectamine 2000、荧光素酶质粒pGL3和荧光素酶检测系统购自Promega公司(美国)。使用由厦门大学(中国)生物医学工程中心提供的恶性人肺腺癌 A549 细胞和正常的 NIH 3T3 成纤维细胞。所有使用的材料均为分析纯,未经进一步纯化。将玻璃器皿彻底清洗并用去离子水冲洗。

DNA序列如下:

AS1411适体:5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3',对照TDO:5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Apt-GS/siRNA 复合物的制备和表征

氨基官能化明胶/二氧化硅纳米凝胶(GS NGs)首先通过溶胶-凝胶程序制备,如前所述[19]。通常,将 0.2 g GPSM 添加到 20 mL 0.75% 明胶的 HCl 溶液(pH =3)中,温度为 60 °C,搅拌 30 分钟,随后添加 0.08 g APTMS,再孵育 24 小时。通过离心(14,000 rpm,25 °C,12 min)3次纯化获得的GS NG。其次,将 GS NGs(0.5 mL,5 g/L 的 PBS)在室温下用 25 uL SPDP(20 mM 的 DMSO)处理 60 分钟,然后加入硫醇化的 AS1411(1 mg/mL)并搅拌12 小时。通过离心(14,000 rpm,25 °C,12 分钟)获得Apt-GS纳米凝胶并用去离子水纯化三次。第三,将获得的SPDP激活的Apt-GS NG悬浮液(80 mL,5 mg/mL)与siRNA有义链在4 °C下直接混合过夜。离心纯化后加入siRNA反义链,94 ℃孵育5 min,47 ℃退火20 min,形成Apt-GS/siRNA复合物。

通过透射电子显微镜 (TEM) (Hitachi S-4300, Japan) 检查 AS1411-GS 和 AS1411-GS/siRNA 复合物的表面形态。通过 Nano-ZS Zetasizer 动态光散射检测器 (Malvern Instruments, UK) 测量每个样品的粒径和 zeta 电位。假设对数正态分布,使用 Malvern Zetasizer 软件从自相关函数计算有效粒径。 GS 和 AS1411 或 siRNA 的结合是通过使用 F-7000 荧光显微镜(Olympus-IX73,日本)收集和测量未连接的 FAM 标记的 DNA 的浓度来确定的。通过茚三酮比色反应定量测定 GS 纳米凝胶表面的总氨基 (-NH2) 水平。量约为0.642 mmol/g。

凝胶电泳分析

使用 TBE 缓冲液中的 2% (w/v) 琼脂糖凝胶在 100 V 下进行凝胶电泳 20-30 分钟。用凝胶记录系统(Tanon GIS-2008,中国)通过辐照观察图像。在 Apt-GS/siRNA 封装试验中,裸 siRNA、GS/siRNA 和 Apt-GS/siRNA 复合物被加载到凝胶中,没有任何添加剂。在氧化还原反应试验中,GS/siRNA 和 Apt-GS/siRNA 复合物在测量前与 10 mM GSH PBS 溶液孵育 2 小时。

体外细胞毒性

通过MTT测定评估对人肺腺癌A549细胞的细胞毒性。简而言之,A549 细胞(1 × 10 4 细胞/孔)接种于聚苯乙烯96孔培养板中,培养24 h至70%汇合。去除培养基后,每孔加入100 μL含有纳米凝胶(100-600 mg/mL)的无血清DMEM培养基。用培养基处理的细胞仅作为阴性对照组。共孵育 24 h 后,加入 100 μL 新鲜培养基和 20 μL MTT 溶液(PBS 缓冲液中 5 mg/mL),再培养 4 h。然后,除去MTT溶液并加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)。在黑暗中振荡 30 min 后,用酶标仪(TECAN DNA export,Swiss)在 490 nm 波长处测量每个孔的吸光度。所有实验一式三份进行。相对细胞活力(%)表示为相对于未处理对照细胞的百分比。

细胞内化

将细胞与 25 μL FAM 标记的 Apt-GS 和 TDO-GS 纳米凝胶 (2 mg/mL) 在无血清培养基中在 37 °C 下共培养 10 小时。 PBS 洗涤 3 次后,用多聚甲醛(PBS 中 4%)固定细胞 30 min,然后用共聚焦激光扫描显微镜(Leica,德国)观察。为了量化细胞摄取,将细胞用 25 μL FAM 标记的 AS1411-GS 和 TDO-GS (2 mg/mL) 在无血清培养基中处理一段时间 (0.5-16 h),温度为 37 °C。为了评估核仁蛋白在 Apt-GS NGs 细胞摄取中的作用,将制备的 Apt-GS NGs 和不同浓度(0.5、5 和 50 μM)的游离 AS1411 适配体的混合物与 A549 细胞一起孵育 8 H。然后,将细胞重新悬浮在冰冷的 PBS 中,并使用 EPICS XL 流式细胞仪(Beckman Coulter,美国)从 10,000 个细胞中计数带有 FAM 标记的纳米凝胶的荧光细胞。使用EPICS XL流式细胞仪软件进行数据分析,选择分析门为1%的对照细胞落在阳性区域内。

基因沉默

使用用于荧光素酶的 siRNA 和表达荧光素酶的细胞的组合来检查沉默基因的能力。简而言之,表达荧光素酶的 A549 (2 × 10 5 细胞/孔)和 NIH 3 T3 成纤维细胞(4 × 10 5 细胞/孔)接种在 12 孔板中并培养过夜,然后用 100 μL 含有 LUC-siRNA(或对照 siRNA)的测试复合物(80 μg/mL)处理 8 小时。样品分为三组:(a) 仅 Apt-GS/siRNA 复合物持续 8 h,(b) Apt-GS/siRNA 复合物持续 8 h,然后脂质体再持续 1 h(命名为 A-GS/si→ Lip 组),和(c)Apt-GS/siRNA 复合物和脂质体共孵育 8 h(A-GS/si+Lip 组)。未经任何处理的细胞和用荧光素酶质粒 pGL3 (Madison, WI, USA) 转染的细胞作为对照。在进一步孵育 40 小时后,根据制造商的方案,通过使用荧光素酶测定系统量化细胞中的荧光素酶表达来研究基因敲低效率。实验一式三份进行,数据显示为平均值 ± 平均值的标准误差。

结果和讨论

GS-AS1411/siRNA 复合物的合成与表征

为了构建靶向癌症的 siRNA 载体,使用溶胶-凝胶方法设计了明胶/二氧化硅-AS1411(Apt-GS)纳米凝胶(方案 1)[19, 20]。典型的 TEM 图像(图 1)显示空白 GS 和 Apt-GS 是分散的球形结构,平均直径为 170-200 nm。 FAM 标记的 DNA 用于合成以确认 AS1411 和 siRNA 与 GS NG 的偶联。 GS 上偶联的适体的量约为 0.65 μmol/g,如使用荧光光谱定量。同时,在荧光图像中可以很容易地观察到强烈的绿色荧光,表明适体 AS1411 和 siRNA 的整合。如图 2 所示,裸 GS、Apt-GS 和 Apt-GS/siRNA NGs(分别为 162.3 nm、216.5 nm 和 234.9 nm)的流体动力学尺寸随着功能化过程而逐渐增加,这是由于表面功能层。另一方面,由于负 DNA 适配体在表面上的掩蔽效应,Apt-GS 的 zeta 电位正 (33.9 ± 0.5 mV) 低于裸 GS NGs (40.1 ± 0.5 mV)。在与表面的 siRNA 进一步结合后,由于来自 siRNA 的过量游离负磷酸基团,Apt-GS/siRNA NGs 的 zeta 电位仍负移至 24.9 mV。该结果表明生物毒性降低,因为强正电荷可以干扰血液中带负电荷的蛋白质并破坏细胞膜[24]。

<图片>

Apt-GS 的图像 (a , c ) 和 Apt-GS/siRNA 纳米凝胶 (b , d )。 , b TEM 图像。比例尺代表 0.5 μm。 c , d 荧光图像。比例尺代表5 μm

<图片>

GS、Apt-GS和Apt-GS/siRNA纳米凝胶的流体动力学尺寸和zeta电位

siRNA 加载和释放

成功的 RNAi 只能在 siRNA 被递送并从其载体迅速释放到细胞质中时发生 [25]。肿瘤细胞的 GSH 浓度比正常细胞高 7-10 倍 [26, 27]。在这项研究中,siRNA 通过二硫化物交联反应与活性 Apt-GS NG 偶联。进行凝胶电泳 (GE) 以评估 Apt-GS/siRNA 复合物的 siRNA 负载和释放能力。正如预期的那样,当游离 pDNA(图 3,第 1-5 道)移动到其通常位置时,Apt-GS/siRNA 复合物在电动迁移试验(图 3,第 10-11 道)中表现出较低的迁移率,证明了良好的加载siRNA。为了模拟细胞内条件,将 10 mM GSH 用复合物处理 2 小时以减少 Apt-GS/siRNA NG。如图 3 泳道 6-7 所示,在 GSH 处理后在聚丙烯酰胺凝胶中观察到 siRNA 分子,表明 Apt-GS/siRNA NGs 可以在谷胱甘肽存在下通过二硫键裂解可逆地释放功能性 siRNA 分子。此外,通过比较2%聚丙烯酰胺凝胶电泳中siRNA和对照siRNA的总量来分析纳米颗粒上siRNA的量。 Apt-GS以每微克3:1∼2:1 pmol的比例包裹siRNA分子。还注意到siRNA和Apt-GS的混合物由于阴性siRNA的物理截留而表现出较弱的保留(图3,泳道8)。

<图片>

siRNA 可逆结合 Apt-GS 纳米凝胶的 AGE 分析。泳道 1–5:游离 siRNA 的数量为 50、40、30、20 和 10 pmol。泳道 6 和 7:GS/siRNA 和 Apt-GS/siRNA,在 2 h 时含有 10 mM GSH。泳道 8:游离 siRNA 和 Apt-GS NGs 的混合物。泳道10和11:GS/siRNA和Apt-GS/siRNA复合物,不含10 mM GSH作为对照

细胞毒性和核仁蛋白靶向

在 A549 细胞中通过 MTT 测定研究了体外细胞毒性评估。 MTT 测定用于评估制备的纳米凝胶的细胞毒性。选择无毒荧光素酶siRNA作为报告基因,对肿瘤细胞没有杀伤作用[28, 29]。因此,细胞活力代表了载体的生物相容性。如图4所示,GS、Apt-Apt和Apt-Apt/siRNA在100-600 μg/mL浓度组(细胞活力> 80%)对细胞增殖没有显着影响,细胞毒性出现剂量-依赖。与裸 GS NG 相比,AS1411 修饰的纳米凝胶由于抑制 NF-κB 信号 [27, 30] 和破坏细胞器膜 [16],细胞活力略有下降。 Apt-GS纳米凝胶良好的生物相容性使其适合作为体内siRNA载体。

<图片>

MTT法测定不同浓度GS、Apt-GS和Apt-GS/siRNA纳米凝胶对A549细胞的细胞活力

为了在体外评估 Apt-GS 在肿瘤细胞中的靶向性,我们将 A549 细胞和 3T3 成纤维细胞与等量的 FAM 标记的 Apt-GS 或对照 TDO-GS(用对照寡核苷酸修饰的 GS)一起孵育。在 3T3 细胞中或用对照 TDO-GS 处理细胞时,可以观察到低水平的荧光(图 5b、c)。相比之下,适体 AS1411 发出的绿色荧光在 A549 癌细胞中显着增强(图 5a),表明由于引入了核素靶向的 AS1411 适体,Apt-GS 在肿瘤细胞中特异性积累。在流式细胞术的定量分析中(图 6),Apt-GS NGs 在两种细胞类型中都表现出时间依赖性荧光强度。从0.5到16 h,A549细胞和3T3细胞中Apt-GS内化的荧光强度分别提高了13倍和2倍。至于含有 NGs 的细胞比例,它在前 30 分钟内迅速增加,并且在 8 小时内 A549.96% 的 A549 细胞在 16 小时内贴附或摄取纳米凝胶,而 3T3 细胞仅 52%被观测到。为了评估核仁蛋白在纳米凝胶细胞摄取中的作用,将制备的 Apt-GS NGs 和不同浓度(0.5、5 和 50 μM)的游离 AS1411 适体的混合物与 A549 细胞孵育 8 小时。当使用游离的 AS1411 适配体与 Apt-GS NGs 竞争在细胞膜上表达的核仁素时,含有纳米凝胶的细胞的荧光强度和百分比分别降低了 50% 和 30%,表明核仁素诱导的受体介导的内吞作用。图 6c)。这些数据表明Apt-GS NGs通过核仁蛋白介导的内化在A549癌细胞中表现出更高的积累。

<图片>

c Apt-GS 和 TDO-GS 纳米凝胶对 FAM-siRNA 的细胞摄取。图像是用 CLSM 拍摄的。绿色信号:FAM。比例尺为 10 μm

<图片>

FAM 标记的 Apt-GS 和 TDO-GS 纳米凝胶在不同细胞类型中的细胞摄取的流式细胞术分析 (FCMS)。插入:FACS 配置文件,a , b 曲线红色、绿色、蓝色、紫色、浅绿色和黄色表示孵育时间为 0.5 到 16 h; c 曲线红、绿、蓝、紫代表AS1411的浓度从0到16 μM

RNA 干扰

据报道,将脱氧核苷酸掺入 siRNA 可以增加有义链的稳定性并保持 ~ 40% 的 RNAi 功效 [2, 3]。为了评估测试 siRNA 载体的击倒效率,我们在两个细胞中都采用了核糖核苷酸替代的荧光素酶报告基因系统。 48 小时后通过荧光素酶活性评估siRNA的基因敲低(KD)效率。如图 7a 所示,与正常 3T3 细胞的 6% 相比,Apt-GS/siRNA 将 A549 细胞的基因敲低效率提高了 4.6 倍,显示出良好的细胞选择性。这表明适体 AS1411 修饰通过产生靶向效应提高了转染效率。阳离子脂质体已被证明有助于货物运输和从溶酶体中逃逸 [31]。此外,尽管存在内体破坏,但随后添加脂质体(A/si-GS →Lip 组)无助于提高 siRNA 介导的基因沉默活性(30.4%),推断通过二硫键裂解在谷胱甘肽 (GSH) 细胞内环境中释放 siRNA .此外,脂质体和 Apt-GS/siRNA(A/si-GS + Lip 组)的共转染略微提高了 A549 中荧光素酶表达的抑制效率(41.6%),尽管脂质体有助于溶酶体逃逸,这与之前的报道一致[27 , 30]。然而,与 3T3 细胞相比,A549 细胞对 A/si-GS→Lip 组和 A/si-GS+Lip 组的基因沉默活性分别是 2.7 倍和 1.4 倍,推断细胞选择性降低。

<图片>

不同处理的Apt-GS纳米凝胶中抗荧光素酶siRNA的体外沉默效应(a ) 和 Apt-GS/siRNA 复合物浓度 (A-GS/si) 对基因沉默 (b )

接下来,我们检查了纳米凝胶对 RNAi 的浓度影响。如图 7b 所示,基因干扰效率在复合物浓度 80 μg/ml 时达到最大值。在 120 μg/ml 的浓度下 KD 效率降低可能是由于适体的细胞毒性增加。还应注意的是,添加内体逃逸剂脂质体可以在低浓度 Apt-GS/siRNA 纳米凝胶(40 μg/ml 和 80 μg/ml)下提高 RNA 干扰效率,但在高浓度(120微克/毫升)。因此,相信Apt-GS可以成功地将siRNA递送至肿瘤细胞并随后产生特异性RNAi。

结论

siRNA 的稳定性和组织特异性递送仍然是 RNAi 治疗的最大障碍。在这里,脱氧核苷酸取代的 siRNA 用于提高 siRNA 的稳定性,并且 GS 核心进一步包被有用于肿瘤靶向的 AS1411 适配体和用于氧化还原响应的 siRNA 递送的二硫键接头。该载体具有球形结构,尺寸约为 200 nm,表面带有正电荷。这些制备的 Apt-GS/siRNA 纳米凝胶可以保护货物并在 DTT 添加下通过二硫键裂解表现出加速的 siRNA 释放。此外,通过靶向适体 AS1411,新的 Apt-GS 纳米凝胶 Apt-GS 可以有效地向细胞质递送和释放更多的货物,从而显着(体外提高~ 5 倍体外)在过表达核素的 A549 细胞中的沉默活性。总体而言,这些发现表明递送脱氧核苷酸取代的siRNA是一种创新策略,这些氧化还原反应性、靶向肿瘤的智能纳米凝胶在siRNA递送和肿瘤治疗方面具有广阔的前景。

数据和材料的可用性

本文包含支持本文结论的数据集。

缩写

APTMS:

3-氨基丙基-三甲氧基硅烷

DMEM:

Dulbecco改良Eagle培养基

DMSO:

二甲亚砜

FAM:

荧光素酰胺

通用:

凝胶电泳

GPSM:

3-环氧丙氧基丙基-三甲氧基硅烷

GS NG:

硅氧烷交联的明胶纳米凝胶

MTT:

3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑

RNAi:

RNA干扰

siRNAs:

小干扰RNA

SPDP:

N -琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯

TDO:

阴性DNA寡核苷酸


纳米材料

  1. 用于增强药物递送的纳米纤维和细丝
  2. 环境响应金属-有机框架作为肿瘤治疗的给药系统
  3. 用于癌症应用的基于细胞的药物递送
  4. 斑马鱼:一种用于纳米技术介导的神经特异性药物递送的有前景的实时模型系统
  5. 131I 追踪的 PLGA-脂质纳米颗粒作为靶向化疗治疗黑色素瘤的药物递送载体
  6. 一种无需有机溶剂的靶向纳米药物增强抗癌功​​效的新方法
  7. 用于细胞内蛋白质递送的二氧化硅纳米颗粒:一种使用绿色荧光蛋白的新型合成方法
  8. 用于索拉非尼递送的基于核苷脂质的纳米载体
  9. 基于纳米脂质体的双重给药系统的理化特性研究
  10. 大型零售商的三个路线规划基础
  11. 当天发货?加快交付速度的五个技巧
  12. 非接触式交付的未来