功能化AS1411适配体的氧化还原响应明胶/二氧化硅纳米凝胶用于靶向siRNA递送

摘要

RNA干扰（RNAi）为基因沉默提供无与伦比的特异性，但siRNA稳定性和精准组织递送仍是限制因素。我们通过二硫键连接器，将明胶基纳米凝胶（GS）与靶向核仁蛋白的AS1411适配体和脱氧核苷酸替代siRNA共轭，构建了双响应系统。该设计允许siRNA瞬时停靠，并在谷胱甘肽（GSH）丰富的肿瘤微环境中触发释放。在核仁蛋白阳性A549细胞中，Apt-GS/siRNA纳米凝胶经细胞内GSH暴露解体，高效将siRNA递送至细胞质，实现强效荧光素酶敲低。细胞毒性实验证实治疗相关浓度下的生物相容性。这些氧化还原响应、肿瘤靶向纳米凝胶代表了siRNA基础癌症治疗的有前景平台。

引言

RNAi利用序列特异性基因沉默，因其精准性和低毒性成为治疗遗传疾病、癌症和传染病的领先候选。与反义寡核苷酸相比，小干扰RNA（siRNA）显示增强的核酸酶抗性。化学修饰——如用脱氧核苷酸替换核糖核苷酸——已被证明能提高siRNA稳定性同时保留~40% RNAi活性。尽管有这些进展，高效、组织特异性递送仍是巨大挑战。

纳米颗粒载体可保护siRNA免受降解并促进靶向递送。核仁蛋白在许多增殖癌细胞表面过表达，是肿瘤特异性摄取的有吸引力靶点。G-四链DNA适配体AS1411（AGRO100）高亲和力结合核仁蛋白，已作为抗癌药物进入II期临床试验。先前研究成功将AS1411共轭至各类纳米材料，实现肿瘤细胞选择性内化。明胶作为可生物降解蛋白，因其优异生物相容性和凝胶性能被用于siRNA封装。我们组先前开发了硅氧烷交联明胶纳米凝胶（GS NGs），具有可控尺寸和表面电荷，展示了体外和体内高效转染。

克服细胞内屏障——特别是内体逃逸和siRNA释放——至关重要。刺激响应连接，如在肿瘤细胞高谷胱甘肽（GSH）环境中可裂解的二硫键，受到广泛关注。二硫键交联载体可在恶性细胞中特异性触发治疗载荷爆发式释放。

本文呈现结合GS NGs、AS1411适配体靶向和二硫键连接子实现氧化还原触发siRNA释放的混合纳米凝胶系统。评估其增强细胞摄取、实现肿瘤特异性基因沉默和维持低细胞毒性的能力。

方法

材料

明胶（Bloom 240-270，pH 4.5-5.5）源自BBI Company Inc.（美国）。SPDP、GPSM、APTMS购自Sigma-Aldrich（美国）。MTT、DMEM、FBS、青霉素、链霉素自Hyclone（美国）。AS1411、5'-FAM-AS1411、阴性对照TDO由桑吉生物（中国）合成。脱氧核苷酸替代Luc-siRNA（正义链：5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'；反义链：3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'；FAM标记反义链）经HPLC纯化由Gene Pharma（中国）提供。Lipofectamine 2000、荧光素酶质粒pGL3、荧光素酶测定系统源自Promega（美国）。A549肺腺癌细胞和NIH 3T3成纤维细胞由厦门大学生物医学工程中心（中国）提供。所有试剂分析纯级；玻璃器皿彻底清洗并用去离子水冲洗。

使用的DNA序列：

AS1411适配体：5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3'
对照TDO：5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Apt-GS/siRNA复合物制备与表征

GS纳米凝胶通过溶胶-凝胶法合成：GPSM（0.2 g）加入20 mL 0.75%明胶HCl溶液（pH 3），60 °C反应30 min，随后加入APTMS（0.08 g）孵育24 h。所得GS NGs经离心（14000 rpm，25 °C，12 min）纯化三次。随后，GS NGs（0.5 mL，5 g L⁻¹ PBS）与SPDP（25 µL，20 mM DMSO）室温反应60 min，再与巯基化AS1411（1 mg mL⁻¹）孵育12 h。Apt-GS纳米凝胶经离心回收，去离子水洗涤三次。SPDP活化Apt-GS NG悬液（80 mL，5 mg mL⁻¹）与siRNA正义链在4 °C过夜混合。纯化后，反义链经94 °C加热5 min、冷却至47 °C退火20 min，形成Apt-GS/siRNA复合物。

透射电镜（TEM，日立S-4300）显示球形颗粒。动态光散射（Malvern Zetasizer）测量流体动力学直径和zeta电位。共轭效率通过FAM标记DNA荧光和茚三酮法测定表面氨基（≈0.642 mmol g⁻¹）量化。

凝胶电泳分析

电泳在TBE缓冲液中2%琼脂糖凝胶，100 V，20-30 min进行。凝胶成像系统捕获图像。释放研究中，GS/siRNA和Apt-GS/siRNA复合物与10 mM GSH（PBS）孵育2 h后上样。

体外细胞毒性

MTT实验在96孔板中A549细胞（1×10⁴ cells/well）进行。24 h达70%融合后，用纳米凝胶（100-600 µg mL⁻¹）在无血清DMEM中处理24 h，随后孵育MTT（5 mg mL⁻¹）4 h。加入DMSO，在490 nm读取吸光度。三次重复；活性（%）相对未处理对照计算。

细胞内化

A549和3T3细胞与25 µL FAM标记Apt-GS或TDO-GS（2 mg mL⁻¹）在无血清培养基中37 °C孵育10 h。4%多聚甲醛固定后，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。流式细胞术中，细胞用FAM标记纳米凝胶（2 mg mL⁻¹）处理0.5-16 h，洗涤、冰冷PBS重悬，在EPICS XL流式细胞仪分析。摄取抑制实验：游离AS1411（0.5、5、50 µM）预孵育细胞8 h后加入纳米凝胶。

基因沉默

A549（2×10⁵ cells/well）和NIH 3T3（4×10⁵ cells/well）细胞用Apt-GS/siRNA复合物（80 µg mL⁻¹）转染8 h。评估三种方案：(a) 单独Apt-GS/siRNA；(b) Apt-GS/siRNA后加脂质体（A-GS/si→Lip）；(c) 同时Apt-GS/siRNA和脂质体（A-GS/si+Lip）。额外40 h后用荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性。数据呈现为均值±SEM（三重复）。

结果与讨论

GS-AS1411/siRNA复合物合成与表征

TEM图像（图1）确认空白GS和Apt-GS纳米凝胶均形成均匀球形颗粒，直径170-200 nm。荧光成像证实AS1411和siRNA成功共轭。定量显示GS上适配体约0.65 µmol g⁻¹。流体动力学尺寸从GS的162.3 nm增至Apt-GS的216.5 nm和Apt-GS/siRNA的234.9 nm，反映表面功能化。Zeta电位从GS的+40.1 mV变为Apt-GS的+33.9 mV和Apt-GS/siRNA的-24.9 mV，表面电荷降低有望减少非特异性蛋白结合和细胞毒性。

siRNA负载与释放

凝胶电泳显示siRNA高效负载于Apt-GS/siRNA复合物，迁移率降低为证（泳道10-11）。经10 mM GSH孵育2 h后siRNA释放（泳道6-7），确认氧化还原触发解体。负载容量估计为3:1至2:1 pmol siRNA/µg纳米凝胶。物理包裹（游离siRNA与GS混合）显示较弱保留，凸显共价连接优势。

细胞毒性与核仁蛋白靶向

MTT实验（图4）显示GS、Apt-GS、Apt-GS/siRNA在100-600 µg mL⁻¹下活性>80%，展现优异生物相容性。Apt-GS活性轻微降低归因于AS1411诱导NF-κB抑制和细胞器破坏。荧光显微镜和流式细胞术（图5、6）确认选择性摄取：Apt-GS在A549细胞内化率96%，3T3成纤维细胞仅52%。游离AS1411竞争使摄取荧光降低50%、阳性细胞百分比降低30%，确认核仁蛋白介导的内吞作用。

RNA干扰

荧光素酶敲低实验（图7a）显示Apt-GS/siRNA在A549细胞实现4.6倍降低，NIH 3T3细胞仅6%，凸显肿瘤特异性。添加脂质体（A-GS/si→Lip）未显著增强沉默（30.4%）相较单独Apt-GS/siRNA，而同步脂质体处理（A-GS/si+Lip）将敲低提至41.6%。80 µg mL⁻¹达最高沉默（~2.7倍优于3T3），120 µg mL⁻¹效率下降可能因细胞毒性增加。

结论

我们构建了氧化还原响应、核仁蛋白靶向纳米凝胶平台，保护脱氧核苷酸修饰siRNA并在GSH丰富的肿瘤细胞质中特异性释放。~200 nm、正电Apt-GS/siRNA纳米凝胶实现强效、肿瘤选择性基因沉默（A549细胞~5倍改善），同时保持低细胞毒性。这些发现验证了结合二硫键化学与适配体靶向实现高效siRNA递送的策略，代表通向临床RNAi疗法的有希望一步。