基于适体修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的高效细胞靶向药物递送系统

介绍

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种严重危害人类健康的异质性恶性肿瘤[1,2,3]。美国每年诊断出大约 6000 例急性淋巴细胞白血病，尤其是儿童和青少年。 ALL是儿童中最常见的癌症，也是20岁前癌症死亡的最常见原因[4]。

放化疗和骨髓造血干细胞移植是 ALL 的标准治疗方法。放疗与大量全身副作用有关，最佳照射部位尚不清楚。由于成本、患者年龄和缺乏供体骨髓，骨髓造血干细胞移植通常不可行。化疗可以有效消除远处病灶，从而防止复发，但大多数抗肿瘤药物中只有一小部分通过循环到达肿瘤。这导致药物生物利用度低，对病变细胞的选择性比正常细胞差，增加了严重不良反应和耐药性的风险。

纳米药物递送系统可以提供比药物本身更有效和更有针对性的抗肿瘤药物递送，包括由肿瘤微环境的特定条件触发的药物释放 [5, 6]。在这些系统中，介孔二氧化硅纳米粒子 (MSN) 因其大的、可改性的表面而引起了人们的关注。孔容积可调，可承载不同数量、不同种类的药物；以及它们良好的生物相容性 [7, 8]。功能反应基团的表面修饰允许创建在特定条件下释放药物的 MSN，而靶向分子的修饰导致 MSN 将药物选择性地递送至所需组织 [9, 10]。

一种与 MSN 兼容的靶向分子是适体，它是单链 DNA 或 RNA，充当“化学抗体”以特异性且紧密地结合目标。与单克隆抗体相比，适体更小，更容易制备和修饰，它们能更好地穿透组织，并且表现出更低的毒性和免疫原性。因此，适配体被广泛用于肿瘤检测和靶向化疗 [11,12,13]。 SELEX 方法已用于鉴定与 CEM 人急性 T 淋巴细胞白血病细胞特异性结合的适体 Sgc8 [14, 15]。 Sgc8 识别 CEM 细胞膜上的蛋白酪氨酸激酶-7 (PTK-7)。在化疗药物和某些纳米材料中加入Sgc8可提高对白血病细胞的靶向杀伤[16, 17]。

我们设计了一种 Sgc8 适配体修饰的荧光二氧化硅纳米粒子系统 (Sgc8-FSNPs)，用于检测白血病细胞，具有高灵敏度和特异性，证明不仅可用于诊断白血病，还可用于靶向递送抗白血病药物 [18] ]。基于这项工作，在本研究中，我们将阿霉素 (Dox) 封装在 MSN 中，并用 Sgc8 修饰（图 1）。所得的 Sgc8-MSN/Dox 显示出良好的药物递送形态和尺寸，纳米颗粒被培养中的白血病细胞选择性吸收，从而有效杀死肿瘤细胞。本研究旨在揭示适体修饰的介孔二氧化硅纳米粒子不仅可以靶向肿瘤的诊断，还可以通过负载药物杀死肿瘤，为肿瘤靶向治疗提供思路。

Sgc8 适配体修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的示意图，用于有效的细胞靶向药物递送系统。 CEM细胞，CCRF-CEM人急性T淋巴细胞白血病细胞； Dox，多柔比星； MSN，改性二氧化硅纳米颗粒； PTK-7，蛋白酪氨酸激酶-7

实验材料和方法

试剂和材料

盐酸多柔比星（Dox）购自北京华丰联合科技有限公司（中国北京）。分析级原硅酸四乙酯 (TEOS) 和 3-三乙氧基甲硅烷基丙胺 (APTES) 购自上海化学试剂一厂（中国上海），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，纯度 99%）购自上海极智生化科技有限公司（中国上海） .所有其他试剂均为分析级。羧基修饰的Sgc8适配体（5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)10-COOH-3′）[16]由上海生物工程（中国上海）合成。

细胞系

以下细胞系购自中国科学院细胞库（中国上海）：人急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM、Ramos人伯基特淋巴瘤B细胞系、L02人正常肝细胞系和 293Thuman 胚胎肾细胞系。所有细胞系均在 37 °C 和 5% CO2 条件下在补充有 10% 胎牛血清（FBS，Hyclone）和青霉素-链霉素（Gibco，Grand Island，NY，USA）的 DMEM 中培养。

准备Sgc8-MSN/Dox

MSNs 的制备如 [19] 所述，将 0.50 g CTAB 溶解在 240 mL 超纯水中，加入 1.75 ml 2 M NaOH 溶液，并在油浴中加热至 80 °C。在剧烈搅拌下，缓慢滴加2.50 mL TEOS，继续搅拌2 h，直至得到白色沉淀。然后将混合物以10,000 rpm离心10 min，除去上清液，用超纯水和无水乙醇交替洗涤沉淀物3次，然后将沉淀物在60 ℃真空烘箱中干燥过夜，得到MSN。

Sgc8-MSN/Dox 通过在三颈烧瓶中混合 0.2365-g MSN 与 23.65 mL 无水乙醇，滴加 710-μL APTES，回流 24 h 获得。用甲醇-HCl溶液(4:1)和去离子水交替洗涤混合物3次，然后干燥得到MSNs-NH2。室温下，将 MSNs-NH2 材料置于 10 mL 离心管中，分散于适量的磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，滴加 Dox (5 mg/mL)，搅拌至24 小时。最后加入羧基修饰的Sgc8适配体(100 nM/mL)，搅拌1 h，离心，PBS洗涤至无色，即得Sgc8-MSN/Dox。

Sgc8-MSN/Dox 的特征

通过XRD D4衍射仪（Bruker Inc.，Germany）测量纳米颗粒的X射线衍射图（XRD）。 N2 吸附-解吸等温线通过比表面积和孔径分析仪（TriStar 3000，GA Inc.，USA）测量。 BET表面积由BET图计算。通过 BJH 方法从等温线的吸附分支估计孔径分布。使用 Nano S 动态光散射分析仪（Malvern Instruments，UK）测量粒度和静电势。每个样品测量 3 次并取平均值。还通过透射电子显微镜（H-7650，东京，日本）在 100 kV 的电子束加速电压下评估粒度和形态。同时，通过 FT-IR 光谱（Nicolet-5700，美国）评估 Sgc8 适体与 MSN 表面的结合。为了检测适配体修饰的MSN/Dox的效率，我们收集Sgc8-MSN/Dox制备过程中的洗涤上清液，在260 nm处测量紫外吸收值，然后用标准曲线法确定用量未结合的适体。所以适配体的修饰量可以通过添加总量减去未结合量来计算。

从 Sgc8-MSN/Dox 发布 Dox

体外测量了 Sgc8-MSN/Dox 释放的 Dox 如下。 Sgc8-MSN/Dox (10 mg) 在 37 °C 下溶解在 10 mL 的 pH 5.0 或 7.4 的缓冲液中，并以 100 rpm 振荡。在预定时间，取出样品，以 5000 rpm 离心 10 分钟，然后使用 Thermo Scientific Microplate Reader（81 Wyman Street, Waltham, USA）在 482 nm [9] 描述的分光光度法测定上清液中的 Dox。

Sgc8-MSN/Dox的定位能力

CEM 或 Ramos 细胞（3 × 10 ⁶ ) 在 PBS 中加入到 15 mL 离心管中，并与 Sgc8-MSN/Dox 或 MSN/Dox（适体浓度，200 nM）混合。 37 °C孵育20-30 min，离心收集细胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。将细胞与 1 mg/ml DAPI 孵育 5 分钟，用 PBS 洗涤 3 次并离心。将细胞沉淀重悬于 PBS 中并置于载玻片上，通过荧光共聚焦显微镜（（Nikon DS-Ri1；Tokyo，Japan）进行分析。

在单独的实验中，CEM 和 Ramos 细胞 (3 × 10 ⁵ ) 重悬于 50 μL PBS、45 μL 结合缓冲液 [PBS 补充有 5 mM MgCl2、4.5 g/L 葡萄糖和 1 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)] 和 10 μL 的混合物中FBS [PBS 补充有 1 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)]，其中包含适体浓度为 200 nM 的指定材料。将混合物在黑暗中在 4 °C 下振摇 30 分钟。细胞在洗涤缓冲液中洗涤，以 1000 rpm 离心 5 分钟，然后再洗涤 3 次。最后，将细胞重悬于 500 μL 洗涤缓冲液中，并通过流式细胞术（Beckman Coulter Epics X L；Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA）进行分析。

MSN 的细胞毒性

使用 MTT 方法评估不含 Dox 或适体的 MSN 的细胞毒性。 96孔板（1.5×10 ⁴ /好）。每孔加入MSNs（100 μL），平板在5%CO2培养箱中37 °C培养24或48 h。每孔加入MTT（20 μL），37 °C再孵育30 min，1500 rpm离心10 min，弃上清。每孔加入DMSO（200 μL），将板在黑暗中振荡10 分钟，然后使用自动酶标仪测量570 nm处的光密度（OD）。每个样品重复检测6次，结果以平均值±标准差表示。

Sgc8-MSN/Dox 杀死细胞

96 孔板中的 CEM、Ramos、293T 和 L-02 细胞 (1 × 10 ⁵ 细胞）与游离的 Dox、MSN/Dox 或 Sgc8-MSN/Dox 以 1、5、10、15 或 20 μg/mL 的 Dox 浓度孵育 24 小时。为了进一步证实Sgc8-MSN/Dox确实通过适配体受体靶向杀伤CEM细胞，我们首先将足够的Sgc8适配体与CEM细胞孵育2 h，然后与sgc8-MSN/Dox以20 μg/的Dox浓度孵育毫升 24 小时。如“MSNs 的细胞毒性”部分所述，使用 MTT 测定法比较活力。

统计分析

结果使用 Student t 进行统计分析 检验和具有最小显着性差异检验的单因素方差分析。所有分析均使用 GraphPad Prism 6.02（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）进行。

结果与讨论

Sgc8-MSN/Dox 的特征

X 射线衍射数据表明合成的纳米粒子在 X 范围内具有典型的六方介孔衍射峰（图 2a），这证实了 MSN 的结构。为了进一步研究MSN的比表面积、孔径分布和介孔参数，我们对MSN进行了氮吸附-解吸试验。 MSN 的 N2 吸附-解吸等温线（图 2b）表现出 IV 型等温线特征，表明具有介孔特征。 BET模型计算的表面积为1389 m ² /G。 BJH 曲线显示颗粒的孔径分布较窄（图 2b，插图）。孔径为5.23 nm，孔体积为2.51 cm ³ /G。大的比表面积和孔容以及丰富的介孔使其具有更强的载药能力，有可能成为优良的药物载体。电子显微镜显示 Sgc8-MSN/Dox 具有良好的分散性和均匀的尺寸，呈球形或椭圆形（图 3a）。 MSN/Dox 在 PBS 中的平均 zeta 电位为 - 26.53 mV，在 Sgc8-MSN/Dox 中降至 - 33.87 mV（图 3b），反映了 Sgc8 适配体上的负电荷 [20]。观察到介孔硅表面的孔道。在 PBS 中，MSN/Dox 的平均水合粒径为 98.35 nm，在连接 Sgc8 适配体以制备 Sgc8-MSN/Dox 后增加到 103.24 nm（图 3c、d）。为了进一步确认 Sgc8-MSN/Dox 的成功结合，进行了 FT-IR 光谱分析。红外光谱如图3e所示。 3400 cm ⁻¹ 的峰值 , 1100 cm ⁻¹ , 和 500 cm ⁻¹ 是二氧化硅的特征峰。峰值约 2400 cm ⁻¹ 是 CTAB 模板剂的峰值。峰值约 1600 cm ⁻¹ 是 NH2 峰。峰值出现在 1700 cm ⁻¹ 被认为是 MSN 中加载的 Dox 的簇基的 C =0 键拉伸特征峰。 1650 cm ⁻¹ 处的新峰 是由于 Sgc8 与 NH2-MSN/Dox 反应产生的席夫碱 (–C=N–)。这些证据证明Sgc8-MSN/Dox给药系统已经制备成功。为了检测适配体修饰的Sgc8-MSN/Dox的效率，我们使用紫外分光光度计测量适配体在260 nm处的吸光度密度（OD），并根据OD值的变化计算适配体修饰纳米粒子的效率纳米粒子表面的适配体修饰前后。适配体溶液和上清液的紫外吸收（UV-Vis）光谱如图 3e 所示。根据计算，Sgc8-MSN/Dox的Sgc8适配体修饰量约为6.87 nmol mg ^–1 Sgc8-MSN/Dox。

一 XRD 和 b MSN的氮吸附等温线； （插图）MSN 的孔体积和孔径分布图

纳米材料的表征。 一 Sgc8-MSN/Dox 的电子显微照片。 b 纳米粒子的电位图。 c的粒度分布 MSN/Dox 和 d Sgc8-MSN/Dox。 e 纳米材料的红外光谱：a MSN，b MSN/Dox 和 c Sgc8-MSN/Dox。 f a 的紫外-可见光谱 Sgc8 适配体解决方案，b Sgc8-MSN/Dox制备过程中洗涤上清

从 Sgc8-MSN/Dox 体外释放 Dox

MSN/Dox 和 Sgc8-MSN/Dox 在 pH 7.4 下缓慢释放药物：在 96 h 内释放的药物不超过 50%（图 4）。这表明 MSN 可以支持持续 96 h 的缓慢药物释放，这可能是因为药物扩散到介孔硅的整个内部通道。在 pH 5.0 时释放速度要快得多，48 h 时释放率达到 60%，96 h 时释放率>80%。 Sgc8-MSN/Dox 和 MSN/Dox 的 Dox 释放曲线几乎相同，表明适体连接不影响纳米颗粒结构。由于肿瘤细胞处于弱酸性环境中，并且 Sgc8 包被的纳米颗粒被内化到核内体中，因此在酸性 pH 下释放更多是有用的 [15]。我们的研究结果支持介孔硅在酸性环境中可以加速药物释放的观点[21, 22]。

Sgc8-MSN/Dox和MSN/Dox在pH 5.0或7.4条件下体外释放阿霉素

Sgc8-MSN/Dox 体外靶向白血病细胞

我们检查了作为靶细胞的 CEM T 淋巴细胞白血病细胞和作为非靶细胞的拉莫斯 B 淋巴瘤细胞对纳米颗粒的摄取。基于流式细胞术，非靶细胞内化 MSN/Dox 的程度与 Sgc8-MSN/Dox 相似，而靶细胞内化适体包被的纳米颗粒的程度比 MSN/Dox 大得多（图 5a）。与这些结果一致，荧光共聚焦显微镜在暴露于 Sgc8-MSN/Dox 的 CEM 细胞内显示出强烈的 Dox 荧光（红色），但在以相同方式处理的拉莫斯细胞内则没有（图 5b）。这些结果反映了 Sgc8 适体针对白血病细胞的既定能力 [20]。 Sgc8 识别 CEM 细胞表面的 PTK-7 [18]，将纳米粒子募集到表面，从而使它们的吸收更有效 [23]。我们的结果表明，Sgc8-MSN/Dox 可以靶向原发和继发部位或循环中表达 PTK-7 的癌细胞，使其可用于控制转移。有可能将我们的 MSN 方法扩展到具有其他靶向特异性的其他适体 [24, 25]。

使用a分析的Sgc8-MSN/Dox体外靶向白血病细胞 流式细胞术和b 荧光显微镜。 CCRF-CEM 和 Romas 细胞与 MSN/Dox 或 Sgc8-MSN/Dox 一起孵育，然后用 DAPI（蓝色）染色。多克斯脸红了。比例尺，100 μm

MSN 的细胞毒性

鉴于生物安全对纳米药物递送系统的重要性 [25]，我们首先检查了空白 MSN 对 CEM、Ramos、293T 和 L-02 细胞的毒性。即使在与高达 100 μg/mL MSN 孵育 48 小时后，所有细胞系的活力仍保持在 90% 以上（图 6）。这表明MSNs的细胞毒性几乎可以忽略不计。

MSN 的体外细胞毒性。 一 CEM，b 拉莫斯，c 293T 和 d 用指定浓度的MSN处理L-02细胞，测定细胞活力

接下来，我们研究了 Sgc8-MSN/Dox 杀死靶肿瘤细胞（CEM 细胞）和非靶细胞（Ramos、293T 和 L-02 细胞）的能力。将细胞与不同浓度的游离 Dox、MSN/Dox 或 Sgc8-MSN/Dox 孵育 24 h，然后使用 MTT 测定评估活力。针对靶 CEM 细胞，游离 Dox 的毒性略高于两种 MSN 制剂，而在相同药物浓度下，Sgc8-MSN/Dox 的毒性明显高于 MSN/Dox（图 7）。针对 Ramos、293T 和 L-02 细胞，游离 Dox 显示出比 MSN 制剂显着更大的毒性，MSN 制剂在有或没有 Sgc8 的情况下表现出相似的毒性。为了进一步证实 Sgc8-MSN/Dox 确实通过适体受体 PTK-7 靶向杀死 CEM 细胞，我们首先将足够的 Sgc8 适体与 CEM 细胞孵育 2 h 以阻断结合位点，然后与 Sgc8 共孵育-MSN/Dox。 MTT测定表明游离适体对CEM细胞没有毒性，在足够的Sgc8适体阻断结合位点后，Sgc8-MSN/Dox的毒性明显低于游离Sgc8-MSN/Dox组（图7e）。这些结果突出了适体靶向药物递送和增强靶细胞杀伤的能力。这种靶向可以帮助减少非靶细胞对药物的摄取，并允许使用较低的剂量；这两种作用都可以降低毒副作用的风险[26]。

免费 DOX、MSN/Dox 和 Sgc8-MSN/Dox 杀死 a 的能力 CEM 单元，b 拉莫斯细胞，c 293T 细胞和 d L-02 电池。 e CEM细胞对游离适体的杀伤能力，阻断（CEM细胞先孵育足量的Sgc8 2 h，然后用sgc8-MSN/Dox孵育），和Sgc8-MSN/Dox

适体可以作为引导分子将药物和各种大分子或纳米载体输送到肿瘤细胞，有时适体也可以起到治疗作用。例如，AS1411适配体可以特异性结合核仁蛋白，核仁蛋白在参与细胞分化、存活、炎症、血管生成和肿瘤发展的肿瘤细胞中和表面表达。 AS1411 适配体可以通过与核仁素结合来诱导异种移植模型（肾癌、肺癌、MX1 乳腺癌和胰腺癌）的生长抑制 [27]。此外，AS1411 适配体功能化的载有阿霉素的脂质体（Apt-Dox-Lip）在乳腺癌上进行了测试，结果显示出巨大的应用潜力[28]。由于其优异的特性，适体已在广泛的临床试验中取得成功。第一个适体于 2005 年获得 FDA 批准[29]，此后越来越多的适体进入临床试验。适体应用于抗肿瘤临床试验，包括前列腺癌[30]、肺癌[31]、急性髓系白血病[32]等。毫无疑问，这些适配体相关的临床试验为改变传统治疗方式带来了新的希望。

近年来，适配体与不同的纳米材料结合用于肿瘤的靶向治疗。可见适配体具有非凡的分子识别和靶向能力。然而，适配体应用的发展仍存在一些不容忽视的问题，例如核酸酶是否影响适配体在体内的稳定性，小分子物质的适配体是否进入体内并容易被人体快速清除。肾脏系统，以及在体内的实际靶向性能是否可行。为了充分发挥基于适体的靶向纳米材料的潜力，更多的体内测试和临床相关实验仍然是当前研究的重点。同时，肿瘤诊疗学是未来发展的重要方向，设计和制备更多多功能生物功能材料无疑是发展趋势。

结论

我们构建了一个适配体修饰的 MSN 传递系统，可以有效地靶向白血病细胞并促进 Dox 的摄取。这种靶向性，再加上 MSN 在酸性条件下缓慢且优先释放药物的能力，可能有助于递送系统在肿瘤部位积聚并持续杀死细胞。通过选择合适的适体，可以使用这种 MSN 方法靶向几乎任何类型的肿瘤细胞。但不可忽视的是，Sgc8-MSN/Dox也可能存在上述问题，其体内稳定性和靶向性还有待进一步研究。接下来，我们将结合之前的研究，将诊断试剂和药物都加载到给药系统中，使其具有靶向诊断和靶向治疗的治疗诊断功能。

缩写

MSN：

介孔硅纳米粒子

Dox：

阿霉素

Sgc8-MSN/Dox：

适配体修饰的介孔二氧化硅给药系统

PTK-7：

蛋白酪氨酸激酶-7

TEOS：

原硅酸四乙酯

APTES：

3-三乙氧基甲硅烷基丙胺

CTAB：

十六烷基三甲基溴化铵

CEM：

CCRF-CEMcells

PBS：

磷酸盐缓冲盐水