用于药物递送的藻蓝蛋白包覆的氧化还原敏感壳寡糖纳米颗粒的合成、表征和评价

背景

具有β-(1-4)-连接的D-结构的壳寡糖(COS) 氨基葡萄糖是一种解聚产物，主要由壳聚糖或几丁质经脱乙酰化和酶水解制备，来源于节肢动物的外骨骼或真菌的细胞壁[1, 2]。值得注意的是，壳聚糖及其改性材料可以去除重金属和染料，其中壳聚糖作为吸附剂[3]。许多研究表明，COS 具有多种生物学特性，例如抗癌、抗炎、抗氧化和免疫刺激 [4]。 COS因其生物相容性、高水溶性和化学修饰性而被认为是一种无毒的药物递送载体材料[5, 6]。

为了提高疏水性抗癌药物的溶解度，降低对正常组织的毒性，医学研究人员一直在研究共聚物，共聚物可以自组装成一定粒径范围的胶束[7, 8]。这些共聚组件可以被动或主动到达并穿透肿瘤部位。胶束由两个独立的功能部分组成：包裹疏水性药物的核心和控制体内药代动力学特性的外壳或冠层 [8]。王等人。 [9] 通过化学修饰将脱氧胆酸接枝到 COS 链上，形成两亲性嵌段共聚物，该共聚物可以在低成本无机溶剂中自组装成胶束。胶束的疏水核含有槲皮素，大大提高了抗癌药物的水溶性，进而提高了槲皮素的生物利用度。

姜黄素 (CUR) 是姜黄的主要化学成分之一 [10]。近年来，许多研究人员对CUR的抗癌特性进行了研究，许多研究证实，这种化学物质可以通过各种信号通路影响肿瘤细胞的生长，增强免疫系统[11]。此外，CUR 是一种具有良好光动力特性的光敏剂 [12]。因此，CUR 是一种很有前景的癌症治疗药物。然而，其较差的溶解性、稳定性和生物利用度限制了其临床应用[13]。为了减轻这些缺点，许多研究人员通过给药系统提高了 CUR 的生物利用度。例如，陈等人。 [14] 设计了一种新型的双pH敏感药物载体，增强了CUR的水溶性，提高了其对肿瘤的治疗效果。

藻蓝蛋白 (PC) 主要从蓝藻中获得，被称为水溶性和捕光色素蛋白，在光合作用过程中起着捕获光并将其转化为化学能的作用 [15]。 PC具有抗癌[16]、抗炎、抗氧化等多种生物学特性，在食品和医药领域备受关注[15, 17]。郝等人。 [16] 发现 PC 通过下调含有 Toll/IL-1 受体结构域的衔接蛋白 (TIRAP) 来抑制非小细胞肺癌细胞的生长。此外，PC 还用于肿瘤的光动力疗法 (PDT)，因为它是一种极好的药物，没有副作用 [18,19,20]。使用 PC 作为荧光探针需要结合特定的识别元素，如生物素、抗体和链霉亲和素 [21, 22]。生物素是一种水溶性维生素，是人体必需的微量营养素，具有靶向肿瘤的特性[23]。与正常细胞相比，生物素特异性受体蛋白，如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白，在几种癌细胞的表面高度过度表达 [24, 25]。因此，生物素化纳米颗粒已被广泛研究通过受体介导的内吞作用进行药物递送[24]。

在本研究中，构建了一种新型的 PC 功能化纳米载体，CUR-BCSC@PCs 的制备如图 1 所示。COS 和 CUR 之间的二硫键有助于两亲载体材料的还原敏感性 [26 ]。 CUR 位于由 COS/PC 壳保护的疏水内核中。生物素和PC之间的相互作用以及带正电荷的COS和带负电荷的PC之间的静电相互作用被用来将PC修饰到CUR-BCSCs的表面上。由于通透性提高、增强的通透性和保留 (EPR) 效应以及生物素受体靶向效应，CUR-BCSC@PC 有望到达肿瘤组织 [27]。在谷胱甘肽浓度高于正常细胞的肿瘤微环境中，CUR-BCSC@PCs 通过硫醇-二硫化物交换反应分解，在肿瘤细胞中实现高药物浓度 [23, 28, 29]。本文所描述的CUR-BCSC@PC纳米递送系统不仅提高了CUR的生物利用度，而且具有在肿瘤的临床治疗中发挥作用的潜力。

CUR-BCSC@PCs的设计与示意图

材料和方法

材料

CUR 购自展云化工有限公司（中国上海）。 COS购自山东维康生物医药科技有限公司。PC购自浙江滨美生物科技有限公司。3.3-二硫代二丙酸购自安道麦斯试剂有限公司（中国上海）。碳化碳二亚胺盐酸盐 (EDCI)、二甲氨基吡啶 (DMAP)、四氢呋喃 (THF)、草酰氯和生物素购自阿拉丁化学有限公司。 L-谷胱甘肽 (GSH) 和 Hoechst 33342 购自 Sigma-Aldrich（上海） ， 中国）。透析袋（MWCO 300 Da）购自北京百拓科技有限公司，甲酰胺由天津富宇精细化工有限公司制备，去离子水为实验室自制。

选择 A549 细胞系（人肺癌细胞）（贝纳培养物保藏中心（中国北京））来评估新型纳米载体的细胞毒性。 A549 细胞在 DMEM（赛尔思生物技术有限公司（山东，烟台，中国））中生长。胎牛血清 (FBS) 从 Hyclone (Logan, UT, USA) 获得。青霉素和链霉素购自 Sigma-Aldrich（中国上海）。 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-溴化四唑(MTT)也购自Sigma-Aldrich（中国上海）。

CUR-BCSC@PCs 的合成

用于制备CUR-BCSC@PCs的合成路线如图2所示。详细的实验步骤描述如下。

COS-S-S-CUR、BCSC、Biotin-COS的合成路线

COS-S-S-CUR的合成

3.3-二硫代二丙酸功能化COS通过酰氯催化的两步反应酯化反应合成。

步骤1：将3.3-二硫代二丙酸（42.05 mg，0.25 mmol）和无水THF（4 mL）装入棕色圆底烧瓶中，用搅拌器溶解酸。然后，将用THF稀释的草酰氯(0.3 mmol)加入到置于冰浴中的烧瓶中。反应保持在35 °C。搅拌3 小时后，旋转蒸发除去未反应的草酰氯。通过上述步骤制备产品1。 CUR溶于3 mL的THF中，其中含有34 μL的三乙胺，在冰浴条件下滴加到装有产物1的烧瓶中，然后搅拌15 min。随后，将混合物在50 °C和氮气氛下搅拌6 小时。所得产物旋蒸除去三乙胺和四氢呋喃，柱层析纯化得到纯品HOOC-S-S-CUR。

步骤 2：将纯产物 HOOC-S-S-CUR 用甲酰胺中的 EDCI (1.2 eq) 和 DMAP (1.2 eq) 活化 2 h。随后，加入溶解在4 mL甲酰胺中的COS并在55 ℃下搅拌12 小时。反应完成后，溶液用透析袋（MWCO 300 Da）透析，冻干12 h。

BCSC 和生物素-COS 的合成

简而言之，将生物素、EDCI 和 DMAP 溶解在 3 mL 甲酰胺中并转移到棕色圆底烧瓶中。在 30 °C 搅拌 2 小时后，将 COS-S-S-CUR 溶解在 3 mL 甲酰胺中并逐滴加入烧瓶中。将反应在 45 °C 下保持 2 天。最终产品在去离子水中透析（MWCO 300 Da）并进行离心和冻干以获得氧化还原敏感的BCSC。此外，生物素-COS的合成采用相同的方法将生物素连接到COS链上。

¹ COS-S-S-CUR、BCSC和生物素-COS的H-NMR以DMSO-D6和D2O的混合物为溶剂进行测定。

制备 CUR-Loaded BCSC 胶束 (CUR-BCSCs)

CUR-BCSCs 是通过自组装方法制备的。将 10 毫克 BCSC 溶解在 4 mL 甲酰胺中，然后与 1 mL 溶解在甲酰胺中的 CUR 溶液 (1 mg/mL) 混合。混合溶液用透析袋（MWCO 300 Da）在去离子水中透析24 小时，每2 小时更换一次去离子水。使用800 nm、450 nm和220 nm的微孔膜过滤CUR-BCSCs。

CUR-BCSC@PC 的准备

将制备的 CUR-BCSC 与 PC 的水溶液 (1.0 mg/mL) 混合，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。随后，使用 100 kDa 离心过滤器去除 PC，并用水冲洗 3 次。最终产物（CUR-BCSC@PC）于4 °C避光保存以备进一步研究。

特征

在 Particle Analyzer Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) 上进行动态激光散射 (DLS) 测量，以观察粒度、zeta 电位和多分散指数 (PI)。通过透射电子显微镜（TEM，H-600；Hitachi，Tokyo，Japan）测量证实了 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 的形态。

封装效率 (EE) 和载药量 (DL)

HPLC (Agilent 1260GB12C) 用于测定纳米颗粒的 EE 和 DL。首先，将 2 mL CUR-BCSCs 或 CUR-BCSC@PCs 与 3 mL 乙腈混合并通过超声破乳，然后将乙腈加入 10 mL。测定前，Phenomenex C18柱的柱温(250 mm × 4. 6 mm, 5 um)调至25 °C，流动相流速设为1.0 mL·min ^{- 1} . 0.5% 冰醋酸与乙腈的比例为 40:60 (v/v)。检测过程中，检测波长为425 nm，进样量20 μL[30]。以下公式用于计算 EE 和 DL：

体外稳定性试验

制备含有GSH（0、20 μM、10 mM）的磷酸盐缓冲盐水（PBS），用CUR-BCSC@PCs处理4 h，观察不同浓度谷胱甘肽在37 °C下粒径的变化。此外，使用粒子分析仪 Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) 在 37 °C 在不同时间点（4、8、12 和 24 h）在 PBS 溶液中研究了 CUR-BCSC@PCs 的流体动力学直径。

CUR-BCSC@PC 的体外 CUR 释放

使用透析方法研究了 CUR-BCSC@PCs 的体外 CUR 释放行为。制备含有谷胱甘肽（GSH：20 μmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L）的PBS溶液，加入0.5%吐温80。将含有不同浓度GSH的PBS缓冲液（45 mL）加入50 mL离心管中；然后，将含有 1 mL CUR-BCSC@PCs 的透析袋放入每个离心管中，在 37 °C 下振荡。在不同时间点（0.2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h）收集2 mL释放介质，并加入新鲜的同类型释放介质，保持其体积不变。采用高效液相色谱法测定收集的释放介质中CUR的浓度。

细胞培养

人肺癌A549细胞在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，37 ℃、5% CO2培养[31, 32]。

体外细胞增殖抑制

使用标准 MTT 测定法评估 CUR、BCSC 胶束 (BCSC)、CUR-BCSC 和 CUR-BCSC@PC 对 A549 细胞系的体外细胞毒性 [33]。将 A549 细胞接种在 96 孔板（每孔 5000 个细胞）中 24 h 使其粘附在壁上。丢弃原始培养基，然后加入 100 μL 新鲜培养基，其中含有游离 CUR、BCSCs、CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs（0.1、1、5、10、15 和 20 μg/mL，基于 CUR）加入培养24 h。未给药的孔用作空白对照。通过去除培养基并加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)使细胞经受MTT测定。在 37 °C 在 5% CO2 气氛中再孵育 4 小时后，将 MTT 溶液替换为 150 μL DMSO 以溶解紫色 MTT-甲臜。随后，使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA）在570 nm处测量各孔的吸光度。

体外细胞摄取和定位

在荧光显微镜（FM，Eclipse E400；Nikon Corporation，Tokyo，Japan）下研究了 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 的细胞摄取能力。 A549细胞以4 × 10 ⁴ 接种于24孔板中 细胞每孔，并与 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs（CUR 浓度：20 μg/mL）在 37 °C 下在含有 5% CO2 的潮湿气氛中共同孵育 1、2 和 4 小时。除去含有药物的培养基后，用PBS洗涤A549细胞3次。然后加入含4%多聚甲醛的PBS 20 min，再用PBS洗涤3次。细胞核经Hoechst 33342染色15 min后倒置荧光显微镜观察。

统计分析

所有实验至少进行 3 次，并表示为平均值 ± SD。使用学生的 t 分析统计测试 测试。 P <0.05 为统计学显着，P <0.01 被认为非常显着。

结果与讨论

COS、COS-S-S-CUR、生物素-COS 和 BCSC 的表征

CUR和CH2-S-S-CH2的主要特征共振出现在 ¹ COS-S-S-CUR 的 H-NMR 谱，证明 CUR 与 COS 链成功结合。与图 3(A) 中 COS 的峰相比，图 3(B) 中呈现的 CUR 特征信号在 6.7 和 7.5 ppm 和 3.75 ppm (-OCH3) 之间的区域中观察到，而2.5 ppm 的 CH2-SS-CH2 没有变化。如图（图 3（C），a，b）所示， ¹ 上的生物素峰 生物素-COS 的 H-NMR 谱为 0.99 ppm (-CH2-) 和 3.39 ppm (-CH-S-)。 ¹ BCSC 的 H-NMR 谱如图 3(D) 所示。在相应位置观察到 CUR 的共振（图 3（D），a，e），在 2.5 ppm 处再次观察到 CH2-S-S-CH2 的特征峰（图 3（D），b）。此外，在 0.09 ppm 和 3.39 ppm 峰值处出现的信号（图 3（D）、c、d）证实了与 COS-S-S-CUR 链相连的生物素的存在。图3(D)中CUR、CH2-SS-CH2和生物素的特征共振与图3(B)和图3(C)一致，表明合成了两亲性材料BCSC成功。

¹ COS (A ), COS-S-S-CUR (B ), 生物素-COS (C ) 和 BCSC (D )

CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 的特征

通过透射电子显微镜（TEM）研究了 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 的形态（图 4（A，B））。 CUR-BCSCs 在电子显微镜下显示出光滑的球形（图 4（A），a），而 CUR-BCSC@PCs 具有近似球形的形状，CUR-BCSC@PCs 周围有绽放层（图 4（B） ), b)这表明PC通过覆盖CUR-BCSCs的表面形成了蛋白质电晕结构。由于大量纳米粒子的存在，观察到 CUR-BCSC@PC 的明显廷德尔效应（图 4（C））。 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 的粒径、PI、zeta 电位、DL（%）和 EE（%）如表 1 所示。在图 5 中，CUR-BCSCs 和 CUR- BCSC@PCs 分别为 97.8 ± 4.2 nm 和 160.3 ± 9.0 nm。同时，CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs的PI值分别为0.181 ± 0.014和0.114 ± 0.024，均小于0.2，表明它们的尺寸均匀。 CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs的zeta电位分别为21.57 ± 0.53和12.90 ± 1.93 mV。由于电负性 PC 涂层，CUR-BCSCs 的 zeta 电位高于 CUR-BCSC@PCs。 CUR-BCSC@PCs的EE高于CUR-BCSCs。

A CUR-BCSCs 和单个 CUR-BCSC 的 TEM 图像。 B CUR-BCSC@PCs 和单个 CUR-BCSC@PC 的 TEM 图像。 C 廷德尔效应和CUR-BCSC@PCs在水中的照片

一 CUR-BCSCs的尺寸分布和zeta电位； b CUR-BCSC@PCs的尺寸分布和zeta电位

CUR-BCSC@PC 的稳定性

如图 6a 所示，由于二硫键的还原性，该键在含有 10 mM GSH 的 PBS 中被裂解，CUR-BCSC@PCs 被分解成聚合物碎片，这些碎片团聚以增加纳米颗粒的粒径.然而，在含有 20 μM GSH 的 PBS 中，粒径的变化很小，这与不含 GSH 的 PBS 显示出相似的结果。如图 6b 所示，在不同时间测量粒径以研究 CUR-BCSC@PCs 在 PBS 中的稳定性，结果表明 CUR-BCSC@PCs 的粒径随时间缓慢增加 [14]。 /P> <图片>

CUR-BCSC@PCs 的稳定性。 一 CUR-BCSC@PCs 在不同 GSH 浓度下的尺寸变化。 b 不同时间PBS中CUR-BCSC@PCs的大小变化

CUR-BCSC@PCs 的还原响应

众所周知，二硫键在肿瘤减少环境中是不稳定的。研究人员利用二硫键连接亲水性聚合物和疏水性药物，制备出两亲性片段，可在水中自组装形成纳米胶束。然后，根据生理环境和肿瘤环境的差异，二硫键在肿瘤部位断裂释放药物[34]。在本研究中，进行了体外药物释放以验证 CUR-BCSC@PCs 是否可以呈现预期的释放特性。研究了 GSH 活化后含有二硫键的 CUR-BCSC@PCs 的还原反应能力。如图 7 所示，与具有 10 mM GSH、pH 7.4 的环境相比，在具有 20 μM GSH、pH 7.4 的培养基中，CUR-BCSC@PCs 的 CUR 释放非常缓慢，该培养基模拟了细胞外环境。此外，与 20 μM GSH 培养基相比，1、5 和 10 mM GSH 在释放行为上表现出显着差异。随着GSH浓度的增加，CUR-BCSC@PCs也促进了CUR的释放，表明药物释放响应GSH浓度。

不同GSH条件下CUR-BCSC@PCs的CUR累积释放

体外细胞毒性

进行 MTT 测定以研究游离 CUR、BCSCs、CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 对 A549 细胞系的细胞毒作用 [35]。细胞活力数据总结在图 8 中。所有 CUR 制剂在细胞增殖抑制方面都表现出剂量依赖性。如图 8 所示，孵育 24 小时后，与 CUR-BCSC@PC 和 CUR-BCSCs 相比，游离 CUR 对所有 A549 细胞的细胞增殖抑制能力略低。对于 A549 细胞，CUR-BCSC@PCs 的抗癌活性优于 BCSCs 和 CUR-BCSCs，这可能是由于出色的细胞摄取。此外，CUR-BCSC@PCs显示出比CUR-BCSCs更高的细胞毒性，表明PC对A549细胞的增殖具有潜在的抑制作用。

不同制剂24 h对A549细胞的体外细胞毒性

体外细胞摄取研究

如图 8 所示，使用倒置荧光显微镜在 1、2 和 4 h 时观察到 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs（CUR：20 μg/mL）处理的 A549 细胞中 CUR 的荧光信号. CUR作为一种绿色荧光探针，同时也是一种抗癌药物，常被用作疏水模型药物来开发新型高效的给药系统。如图 9a 所示，CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 都被 A549 细胞系吸收，并且吸收效率是时间依赖性的。由于癌细胞表面过表达的生物素受体，负载生物素的纳米胶束对 A549 细胞具有亲和力。 CUR-BCSC@PCs 的荧光信号在 4 h 时很高，表明 CUR-BCSC@PCs 的细胞摄取率很高。 CUR-BCSC@PCs的荧光信号在4 h时高于1 h或2 h；这证明细胞摄取具有时间依赖性。

一 CUR-BCSCs 和 CUR-BCSC@PCs 在不同时间的细胞摄取的荧光成像。 b CUR-BCSC@PCs 在 1 h 和 4 h 时的细胞位置

A549细胞核经Hoechst 33342染色，如图9b所示，CUR-BCSC@PCs 1 h组细胞质出现绿色荧光信号，4 h组细胞核逐渐出现荧光一组CUR-BCSC@PCs，通过小窝介导的内吞作用证明了细胞摄取。

结论

在这项研究中，通过缩合反应、自组装行为以及 PC 和 CUR-BCSC 之间的相互作用制备了一种蛋白质功能化的 COS 纳米颗粒。经过初步研究，成功合成了具有氧化还原敏感性的两亲载体材料（BCSCs），并使用 ¹ 进行了验证。 核磁共振。 CUR-BCSCs 表面用一层藻蓝蛋白冠修饰，可以提高细胞摄取效率并保护 CUR-BCSC@PCs 免受血浆蛋白吸附。细胞毒性和摄取分析表明，CUR-BCSC@PCs 可以将 CUR 转运到 A549 细胞中，并具有优异的抗增殖特性。考虑到PC和CUR的PDT效应，我们将在下一阶段的研究中评估CUR-BCSC@PCs在光疗下的光动力特性和抗癌活性。该研究为提高抗癌药物疗效和引入功能性蛋白冠铺平了道路。综上所述，基于COS的多功能CUR-BCSC@PCs纳米药物载体生物材料为肿瘤治疗提供了新的策略，具有广阔的应用前景。

数据和材料的可用性

本手稿中的结论是基于本文提供和展示的所有数据。

缩写

BCSC：

生物素-壳寡糖-二硫代二丙酸-姜黄素

COS：

壳寡糖

COS-S-S-CUR：

壳寡糖-二硫代二丙酸-姜黄素

CUR：

姜黄素

CUR-BCSC@PC：

藻蓝蛋白功能化负载姜黄素生物素-壳聚糖寡糖-二硫代二丙酸-姜黄素胶束

CUR-BCSCs：

负载姜黄素的生物素-壳寡糖-二硫代二丙酸-姜黄素胶束

EPR：

增强渗透性和滞留性

PC：

藻蓝蛋白

PDT：

光动力疗法