用于靶向递送多柔比星的抗 Epcam 适体 (Syl3c) 功能化脂质体：携带 C26 结肠癌小鼠的体外和体内抗肿瘤研究

结论

在这里，我们通过插入后 (ED-lip) 使用抗 EpCAM (SYLC3) 适体对 Caelyx® 进行了表面功能化。流式细胞术和荧光显微镜显示 C26 细胞中高水平的 DOX 摄取表明适体可以提高 ED-lip 的内化过程速率。药代动力学数据表明，与 Caelyx® 相比，后插入 DSPE-mPEG-EpCAM 并未改变 DOX 的药代动力学。然而，组织生物分布表明，即使在注射后 72 小时后，与 Caelyx® 相比，ED-lip 的肿瘤积累更多。我们证明 ED-lip 在携带 C26 肿瘤的小鼠中具有改善的治疗效果。 ED-lip 治疗小鼠存活参数的改善表明 EpCAM 靶向 DOX 脂质体是一种很有前途的治疗癌症的药物载体，值得进一步研究。

材料和方法

材料

5'-胺-抗-EpCAM DNA适体（5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3'的序列）（SYL3C）购自BIONEER（生物技术公司，大田，韩国）。 DSPE-mPEG2000-COOH 购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)。 Dowex®、1-Ethyl-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、青霉素链霉素和 Fluoroshield™ 与 DAPI 购自 Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。市售 caelyx® 购自 Behestan Darou Company（伊朗德黑兰）。

DSPE-mPEG2000 与适体的结合

抗 EpCAM 适配体通过抗 EpCAM 适配体的伯胺 (-NH2) 与 DSPE-mPEG2000 的羧基 (-COOH) 共价结合而与 DSPE-mPEG2000 相连（图 1）。偶联是通过 EDC/NHS 偶联化学进行的 [51]。简而言之，将 DSPE-mPEG2000 分散在 2-(N-吗啉代) 乙磺酸 (MES) 缓冲液 (pH 6.5) 中，并将 EDC/NHS 400 mM EDC 和 100 mM NHS 添加到分散体中。该分散体允许搅拌 15 分钟以激活脂质的羧基。然后，将抗 EpCAM 适配体加入到分散体中，并在室温下黑暗中搅拌接下来的 2 小时。脂质与抗EpCAM适配体的摩尔比为1：1，EDC/NHS的摩尔比为脂质的10倍。

使用 DSPE-mPEG-Anti-EpCAM 适配体修改 Caelyx®

ED-lip是通过后插入法合成的。为了进行后插入，在 60 °C 下将 DSPE-mPEG-anti-EpCAM 适配体胶束添加到 1 ml caelyx® 中 30 分钟。 DSPE-mPEG-EpCAM 适配体的量根据 Bartlett 磷酸盐测定法确定 [52]。基于大约 10 ¹⁴ 每毫升 caelyx® 的脂质体数量 ，将 DSPE-mPEG-anti-EpCAM 的体积调整为每个脂质体达到 10 个适体 [36]。琼脂糖凝胶电泳用于确认插入后[39]。

物理化学表征

粒度、多分散指数 (PDI) 和表面电荷由动态光散射仪 (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK) 测定。为了去除游离的 DOX，脂质体与 Dowex® 树脂混合并旋转 60 分钟，然后通过 Poly-Prep 柱（Bio-Rad Laboratories Inc.）去除 Dowex® [53]。脂质体制剂中 DOX 的含量使用 LS-45 荧光分光光度计（Perkin-Elmer，UK）测定（激发：发射 485:590 nm）。

发布研究

为了评估 DOX 的释放，将 1 ml 制剂加入 9 ml 葡萄糖（含 50% 胎牛血清 (FBS)）并在特定时间间隔（0、1、2、4、6、12 和24 小时），取样。用 Dowex® 树脂去除游离 DOX 后，通过荧光分光光度计测定脂质体中残留的药物量并计算释放百分比[39]。

细胞培养

C26结肠癌和中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞系购自伊朗巴斯德研究所。细胞系在 RPMI1640 培养基中培养，该培养基补充有从 Gibco（Thermos Fisher Scientific，美国）获得的 10% FBS、100 IU/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素。细胞在 37 ^° C 5% CO2 和 95% 空气加湿气氛。

细胞相互作用和细胞摄取分析

分别在 4 °C 和 37 °C 下评估制剂的细胞相互作用和细胞摄取。在该测试中选择了两个细胞系，CHO-K1 和 C26。接种于 12 孔板（2.5 × 10 ⁵ 每口井）。在 37°C 下孵育过夜后，将添加到细胞和平板中的处理物置于 4°C 和 37°C 下并再孵育 3 小时。然后用PBS洗涤细胞，并用胰蛋白酶消化。使用流式细胞术（BD FACSCalibur 细胞仪）测定 DOX 的荧光强度。数据采用FlowJo 7.0版软件进行分析。

荧光显微镜评估

1×10 ⁶ 的个数 每孔细胞数 C26 将细胞接种到 6 孔板中，其中已经插入了无菌显微盖玻片。在 37 °C 和 5% 湿度下孵育过夜后，用游离 DOX、Caelyx® 和 ED-lip 处理细胞 24 小时以完全吸收细胞 [54]。然后用PBS洗涤细胞并用4%甲醛固定。用 Fluoroshield™ 和 DAPI 染色的盖玻片安装在载玻片上。处理一式三份进行。从每张载玻片中，在 × 200 放大倍数下选择了六个区域。 DOX 的内在荧光用于评估药物细胞摄取。根据每个显微镜视野中显示 DOX 细胞摄取的细胞百分比进行缩放：

1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80%, 5:80–100%

细胞毒性评价

通过 MTT 法测定游离 DOX、caelyx® 和 ED-lip 的 IC50 值。为此，CHO-K1 和 C26 细胞以 5 × 10 ³ 的密度接种 37 °C 下 96 孔板中每孔细胞数。过夜孵育后，脂质体制剂和游离 DOX 溶液在不含 FBS 的培养基中连续稀释并加入细胞培养物中，并在 37°C 下孵育 1、3 和 6 小时。然后，洗涤​​细胞并培养72小时。在 Stat-Fax 2100 酶标仪 (Awareness Technology Inc. USA) 上使用 570 nm 的光谱吸光度在 630 nm 的背景下测量光密度 (OD)。然后计算IC50值。

动物研究

雌性 BALB/c 小鼠（4-6 周，18-20 克）被关在单独的笼子里，温度为 22±2°C，并以标准颗粒饮食和随意饮水维持。腹膜内 (i.p) 注射氯胺酮和甲苯噻嗪（100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪）用于麻醉动物 [55]。 3×10 ⁵ 的个数 每只小鼠的 C26 细胞在 60 μl PBS 中在右侧皮下注射。接种两周后肿瘤大小增长约 5 mm ³ , 小鼠随机分为 3 组 (n =3 用于生物分布和 n =每组抗肿瘤研究小鼠 5 只）。所有实验方案均经马什哈德医科大学动物伦理委员会批准，并按照国际规则进行，考虑到动物权利。

生物分布和药代动力学研究

肿瘤接种后 14 天，小鼠用 10 mg/kg 剂量的 caelyx® 和 ED-lip 经尾静脉静脉（i.v.）治疗。对照组接受200 μl PBS溶液。在特定的时间间隔（3、12、24、48 和 72 小时）对注射后的小鼠实施安乐死，并收集血液样本和组织样本（肝、脾、肾、肺、心脏和肿瘤）。然后，使用 LS-45 荧光分光光度计 (Perkin-Elmer, UK) 基于每个样品的荧光强度测量每个样品中阿霉素的浓度。测量每个样品的多柔比星浓度，并根据血液浓度与时间曲线计算药代动力学参数的非房室分析。然后参数包括浓度-时间曲线下（AUC）和一阶矩曲线下面积（AUMC），半衰期（t 1/2), 分布容积 (V d), C 最大值，T 计算最大、平均停留时间（MRT）和清除率（Cl）。

体内抗肿瘤活性

为了评估抗肿瘤活性，在接种肿瘤 10 天后，对具有可触及肿瘤大小的小鼠进行单次静脉注射。 Caelyx® 和 ED-lip 的剂量为 10 mg/kg。 PBS 注射到小鼠体内，作为阴性对照。确定了包括到达终点时间 (TTE)、肿瘤生长延迟百分比 (TGD)、中位生存时间 (MST) 和生存率在内的参数。在研究期间，观察小鼠的健康和体重变化。还使用数显卡尺测量肿瘤体积并计算如下：

考虑到伦理方面，如果肿瘤生长> 1000 mm ³ ，小鼠被移除 , 或> 20% 的体重减轻或出现虚弱迹象。

统计分析

使用 GraphPad Prism 6.0（GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA）分析数据。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。 t 测试用于评估制剂的释放研究、流式细胞术和生物分布的结果。方差分析用于评估荧光显微镜和肿瘤体积的结果。用于计算生存参数的 Kaplan-Meier 方法包​​括 TTE、MST 和 TGD%。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

数据和材料的可用性

支持本文结论的所有数据均包含在本文中。

缩写

EpCAM：

上皮细胞粘附分子

NDDS：

纳米给药系统

DOX：

阿霉素

EPR：

增强渗透性和滞留性

ECM：

细胞外基质

CSC：

癌症干细胞

TIC：

肿瘤起始细胞

MFI：

平均荧光强度

MPS：

单核吞噬系统

EDC：

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺

NHS：

N-羟基琥珀酰亚胺

PDI：

多分散指数

DLS：

动态光散射仪

FBS：

胎牛血清

OD：

光密度

AUC：

浓度-时间曲线下面积

AUMC：

一阶矩曲线下面积

t ½ :

半条命

V d:

分发量

捷运：

平均停留时间

Cl：

清关

TTE：

到达终点的时间

TGD：

肿瘤生长延迟百分比

MST：

中位生存时间

i.p.：

腹腔注射

i.v.：

静脉注射