用于靶向递送多柔比星的抗 Epcam 适体 (Syl3c) 功能化脂质体:携带 C26 结肠癌小鼠的体外和体内抗肿瘤研究
摘要
在这项研究中,我们通过将抗 EpCAM 适体结合的 DSPE-mPEG2000 后插入到 Caelyx®(ED-lip)中,使用抗 EpCAM(上皮细胞粘附分子)适体对表面功能化的聚乙二醇化纳米脂质体阿霉素 (DOX) 进行了处理。确定了制剂的大小、电荷、释放曲线以及细胞毒性和细胞摄取。 ED 唇的特征表明尺寸和 PDI 略有增加,同时 zeta 电位降低,这表明后插入有效完成。流式细胞术和荧光显微镜的结果表明,与 Caelyx® 相比,ED-lip 提高了 C26 细胞系的细胞摄取率。 ED-lip 还具有比 Caelyx® 更多的细胞毒性作用,这表明抗 EpCAM 适体作为靶向配体的功效。制剂在携带 C26 肿瘤的小鼠中的药代动力学和组织生物分布表明,与动物模型中的 Caelyx® 相比,ED-lip 不影响 DOX 的分布特征。此外,与 Caelyx® 相比,ED-lip 有效改善了 DOX 的肿瘤积累并促进了动物的存活。这些结果表明,Caelyx® 与抗 EpCAM 适配体的功能化在癌症治疗中具有前景,值得进一步研究。
介绍
大小为 100-200 nm 的纳米药物递送系统 (NDDS) 通过增强的渗透性和保留 (EPR) 效应被动地积累在肿瘤微环境中。这是通过松散的内皮衬里和薄弱的淋巴引流发生的。然而,最近的数据表明,只有不到 1% 的给药药物可以到达肿瘤部位 [1]。缺乏穿透肿瘤致密细胞外基质 (ECM) 的能力、释放的药物返回循环以及肿瘤的异质性是造成这种失败的原因 [2]。已使用不同的策略通过内源性和外源性刺激来改善 NDDS 的肿瘤积累 [3]。这些 NDDS 可以对光等外源刺激做出反应,并具有用于肿瘤成像的能力 [4]。有许多不同的无机纳米材料可以用作抗癌剂 [5, 6]。然而,对于无机纳米材料,必须注意其毒性和环境安全性[7,8,9,10,11]。
主动靶向递送是一种重要的方法,可帮助 NDDS 更有效地向肿瘤递送治疗剂,并最大限度地减少对非靶组织的暴露 [12, 13]。一种理想的靶向递送靶向剂是对特定细胞或组织成分上调的细胞表面蛋白或受体具有亲和力的分子[14]。
上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 是一种跨膜糖蛋白,被认为是主动靶向的候选配体。最近的研究结果表明,EpCAM 具有正常的低表达健康上皮细胞,而在癌细胞中,其表达水平更高(高达 1000 倍)[15,16,17]。在癌症发展过程中,EpCAM 的表达模式从正常上皮的基底和基底外侧膜转变为肿瘤上皮细胞的顶端表面 [18]。这种差异表达使EpCAM成为一种非常有趣的药物递送配体,可以提高药物的治疗指数[19]。
EpCAM 被证明是癌症干细胞 (CSC) 或肿瘤起始细胞 (TIC) 标志物,其在癌症中的表达与不良预后有关 [20]。 CSC 或 TIC 是具有自我更新能力的细胞,能够产生更多相同类型的细胞,在肿瘤发展和转移中起关键作用 [21]。已经报道了 EpCAM 在各种实体瘤的 CSC 中的过度表达 [22]。最近,适体在广泛的研究范围内引起了广泛关注,并作为一种潜在的强大分子出现,可在 NDDS 中用作靶向配体 [23, 24]。适体是基于 DNA 或 RNA 的寡核苷酸序列,具有二级和三级结构,这些结构与其靶标(例如细胞表面受体)具有亲和力 [23, 24]。适体也有几个优点,例如,它们是非免疫原性的,具有低分子量 (8-25 kDa),具有化学和热稳定性。此外,它们的合成和化学修饰成本低且可扩展[25]。通过抗 EpCAM 特异性适体选择性靶向 NDDS 可被视为将化疗药物输送到肿瘤微环境中的有效靶向选择 [19, 26]。对此,不同的研究表明,抗EpCAM适配体功能化纳米载体可以有效提高抗癌药物向肿瘤细胞的传递[15,27,28]。
本研究的目标是开发一种抗 EpCAM DNA 适体 (SYL3C)-PEG 化纳米脂质体,其负载阿霉素 (DOX) (ED-lip) 作为 NDDS 模型。这种功能化是通过适体的胺基和 DSPE-mPEG2000 的羧基之间的 EDC/NHS 偶联化学进行的,它被后插入到脂质体中,如图 1 所示。ED-lip 的特征在于大小、zeta 电位和阿霉素包封率、释放曲线和细胞毒性。然后,我们评估了这些ED-lip是否可以提高体外细胞摄取并通过靶向在携带C26结肠癌肿瘤的小鼠中将DOX递送至肿瘤。
结果与讨论
Caelyx®,聚乙二醇化脂质体阿霉素是最广泛使用的化学治疗剂之一,是第一个获得 FDA 批准的纳米颗粒,已用于治疗卵巢癌、艾滋病相关的卡波西肉瘤和多发性骨髓瘤。 Caelyx® 通过 EPR 效应被动渗透到肿瘤部位 [29]。虽然,Caelyx® 显着改善了 DOX 的药代动力学和半衰期;然而,Caelyx® 的主要局限性是肿瘤部位的细胞摄取不足和药物释放率低 [29]。在这里,我们使用SYL3C适配体作为靶向配体,将脂质体阿霉素(ED-lip)功能化以靶向癌细胞表面的EpCAM分子,从而通过主动靶向的过程将DOX递送至特定靶点。
DSPE-mPEG2000 与适体的结合
在本研究中,我们使用 EDC/NHS 偶联化学将胺功能化的抗 EpCAM 适配体与 DSPE-mPEG2000-COOH 的活性羧基结合。这种使用 EDC/NHS 偶联化学和酰胺键形成的偶联反应的优势在于其稳定性和减少适体之间的非特异性相互作用 [30]。适配体可以用伯胺或硫醇基团修饰并共价结合以分别激活马来酰亚胺的羧基或吡咯基团 [31]。用硫醇基团修饰的适体与 DSPE-PEG2000 的马来酰亚胺官能团缀合。然后,DSPE-PEG2000-aptamer 后插入脂质体结构以装饰脂质体的外表面 [32]。马来酰亚胺硫醇化学的一个重要限制是,在储存期间适体的硫醇基团可能会受到氧化的影响,并导致两个硫醇修饰的适体之间形成二硫键 (S-S)。这些二聚体适体不能参与与 DSPE-PEG2000 的马来酰亚胺官能团的缀合反应 [30]。因此,EDC/NHS反应的使用提高了产物收率,并改善了插入后方法。
适配体与抗体相比具有一些优势,包括易于合成和放大、低全身毒性和缺乏免疫原性 [33]。在这里,在适体与脂质结合后,采用插入后方法来制备抗 EpCAM 适体装饰的 Caelyx® (ED-lip)。一般来说,后插入技术是将适配体连接到脂质体表面的简单有效的方法,并且提供了更高的适配体掺入脂质体的速率[34]。
我们使用凝胶电泳迁移率变化测定来评估抗 EpCAM 适配体在脂质体上的插入后情况。如图 2 所示,带负电荷的适配体在凝胶中迁移并观察到它们的带,而 ED-lip 配方没有任何对应带,因为 ED-lip 被困在井线中并且无法穿过凝胶。这些结果表明适体结合的胶束成功后插入到脂质体表面。
结论
在这里,我们通过插入后 (ED-lip) 使用抗 EpCAM (SYLC3) 适体对 Caelyx® 进行了表面功能化。流式细胞术和荧光显微镜显示 C26 细胞中高水平的 DOX 摄取表明适体可以提高 ED-lip 的内化过程速率。药代动力学数据表明,与 Caelyx® 相比,后插入 DSPE-mPEG-EpCAM 并未改变 DOX 的药代动力学。然而,组织生物分布表明,即使在注射后 72 小时后,与 Caelyx® 相比,ED-lip 的肿瘤积累更多。我们证明 ED-lip 在携带 C26 肿瘤的小鼠中具有改善的治疗效果。 ED-lip 治疗小鼠存活参数的改善表明 EpCAM 靶向 DOX 脂质体是一种很有前途的治疗癌症的药物载体,值得进一步研究。
材料和方法
材料
5'-胺-抗-EpCAM DNA适体(5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3'的序列)(SYL3C)购自BIONEER(生物技术公司,大田,韩国)。 DSPE-mPEG2000-COOH 购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)。 Dowex®、1-Ethyl-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、青霉素链霉素和 Fluoroshield™ 与 DAPI 购自 Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。市售 caelyx® 购自 Behestan Darou Company(伊朗德黑兰)。
DSPE-mPEG2000 与适体的结合
抗 EpCAM 适配体通过抗 EpCAM 适配体的伯胺 (-NH2) 与 DSPE-mPEG2000 的羧基 (-COOH) 共价结合而与 DSPE-mPEG2000 相连(图 1)。偶联是通过 EDC/NHS 偶联化学进行的 [51]。简而言之,将 DSPE-mPEG2000 分散在 2-(N-吗啉代) 乙磺酸 (MES) 缓冲液 (pH 6.5) 中,并将 EDC/NHS 400 mM EDC 和 100 mM NHS 添加到分散体中。该分散体允许搅拌 15 分钟以激活脂质的羧基。然后,将抗 EpCAM 适配体加入到分散体中,并在室温下黑暗中搅拌接下来的 2 小时。脂质与抗EpCAM适配体的摩尔比为1:1,EDC/NHS的摩尔比为脂质的10倍。
使用 DSPE-mPEG-Anti-EpCAM 适配体修改 Caelyx®
ED-lip是通过后插入法合成的。为了进行后插入,在 60 °C 下将 DSPE-mPEG-anti-EpCAM 适配体胶束添加到 1 ml caelyx® 中 30 分钟。 DSPE-mPEG-EpCAM 适配体的量根据 Bartlett 磷酸盐测定法确定 [52]。基于大约 10 14 每毫升 caelyx® 的脂质体数量 ,将 DSPE-mPEG-anti-EpCAM 的体积调整为每个脂质体达到 10 个适体 [36]。琼脂糖凝胶电泳用于确认插入后[39]。
物理化学表征
粒度、多分散指数 (PDI) 和表面电荷由动态光散射仪 (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK) 测定。为了去除游离的 DOX,脂质体与 Dowex® 树脂混合并旋转 60 分钟,然后通过 Poly-Prep 柱(Bio-Rad Laboratories Inc.)去除 Dowex® [53]。脂质体制剂中 DOX 的含量使用 LS-45 荧光分光光度计(Perkin-Elmer,UK)测定(激发:发射 485:590 nm)。
发布研究
为了评估 DOX 的释放,将 1 ml 制剂加入 9 ml 葡萄糖(含 50% 胎牛血清 (FBS))并在特定时间间隔(0、1、2、4、6、12 和24 小时),取样。用 Dowex® 树脂去除游离 DOX 后,通过荧光分光光度计测定脂质体中残留的药物量并计算释放百分比[39]。
细胞培养
C26结肠癌和中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞系购自伊朗巴斯德研究所。细胞系在 RPMI1640 培养基中培养,该培养基补充有从 Gibco(Thermos Fisher Scientific,美国)获得的 10% FBS、100 IU/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素。细胞在 37 ° C 5% CO2 和 95% 空气加湿气氛。
细胞相互作用和细胞摄取分析
分别在 4 °C 和 37 °C 下评估制剂的细胞相互作用和细胞摄取。在该测试中选择了两个细胞系,CHO-K1 和 C26。接种于 12 孔板(2.5 × 10 5 每口井)。在 37°C 下孵育过夜后,将添加到细胞和平板中的处理物置于 4°C 和 37°C 下并再孵育 3 小时。然后用PBS洗涤细胞,并用胰蛋白酶消化。使用流式细胞术(BD FACSCalibur 细胞仪)测定 DOX 的荧光强度。数据采用FlowJo 7.0版软件进行分析。
荧光显微镜评估
1×10 6 的个数 每孔细胞数 C26 将细胞接种到 6 孔板中,其中已经插入了无菌显微盖玻片。在 37 °C 和 5% 湿度下孵育过夜后,用游离 DOX、Caelyx® 和 ED-lip 处理细胞 24 小时以完全吸收细胞 [54]。然后用PBS洗涤细胞并用4%甲醛固定。用 Fluoroshield™ 和 DAPI 染色的盖玻片安装在载玻片上。处理一式三份进行。从每张载玻片中,在 × 200 放大倍数下选择了六个区域。 DOX 的内在荧光用于评估药物细胞摄取。根据每个显微镜视野中显示 DOX 细胞摄取的细胞百分比进行缩放:
1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80%, 5:80–100%
细胞毒性评价
通过 MTT 法测定游离 DOX、caelyx® 和 ED-lip 的 IC50 值。为此,CHO-K1 和 C26 细胞以 5 × 10 3 的密度接种 37 °C 下 96 孔板中每孔细胞数。过夜孵育后,脂质体制剂和游离 DOX 溶液在不含 FBS 的培养基中连续稀释并加入细胞培养物中,并在 37°C 下孵育 1、3 和 6 小时。然后,洗涤细胞并培养72小时。在 Stat-Fax 2100 酶标仪 (Awareness Technology Inc. USA) 上使用 570 nm 的光谱吸光度在 630 nm 的背景下测量光密度 (OD)。然后计算IC50值。
动物研究
雌性 BALB/c 小鼠(4-6 周,18-20 克)被关在单独的笼子里,温度为 22±2°C,并以标准颗粒饮食和随意饮水维持。腹膜内 (i.p) 注射氯胺酮和甲苯噻嗪(100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪)用于麻醉动物 [55]。 3×10 5 的个数 每只小鼠的 C26 细胞在 60 μl PBS 中在右侧皮下注射。接种两周后肿瘤大小增长约 5 mm 3 , 小鼠随机分为 3 组 (n =3 用于生物分布和 n =每组抗肿瘤研究小鼠 5 只)。所有实验方案均经马什哈德医科大学动物伦理委员会批准,并按照国际规则进行,考虑到动物权利。
生物分布和药代动力学研究
肿瘤接种后 14 天,小鼠用 10 mg/kg 剂量的 caelyx® 和 ED-lip 经尾静脉静脉(i.v.)治疗。对照组接受200 μl PBS溶液。在特定的时间间隔(3、12、24、48 和 72 小时)对注射后的小鼠实施安乐死,并收集血液样本和组织样本(肝、脾、肾、肺、心脏和肿瘤)。然后,使用 LS-45 荧光分光光度计 (Perkin-Elmer, UK) 基于每个样品的荧光强度测量每个样品中阿霉素的浓度。测量每个样品的多柔比星浓度,并根据血液浓度与时间曲线计算药代动力学参数的非房室分析。然后参数包括浓度-时间曲线下(AUC)和一阶矩曲线下面积(AUMC),半衰期(t 1/2), 分布容积 (V d), C 最大值,T 计算最大、平均停留时间(MRT)和清除率(Cl)。
体内抗肿瘤活性
为了评估抗肿瘤活性,在接种肿瘤 10 天后,对具有可触及肿瘤大小的小鼠进行单次静脉注射。 Caelyx® 和 ED-lip 的剂量为 10 mg/kg。 PBS 注射到小鼠体内,作为阴性对照。确定了包括到达终点时间 (TTE)、肿瘤生长延迟百分比 (TGD)、中位生存时间 (MST) 和生存率在内的参数。在研究期间,观察小鼠的健康和体重变化。还使用数显卡尺测量肿瘤体积并计算如下:
$$ \mathrm{Tumor}\ \mathrm{Volume}=\left(\mathrm{Height}\times \mathrm{Length}\times \mathrm{Width}\right)\times 0.52 $$考虑到伦理方面,如果肿瘤生长> 1000 mm 3 ,小鼠被移除 , 或> 20% 的体重减轻或出现虚弱迹象。
统计分析
使用 GraphPad Prism 6.0(GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA)分析数据。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。 t 测试用于评估制剂的释放研究、流式细胞术和生物分布的结果。方差分析用于评估荧光显微镜和肿瘤体积的结果。用于计算生存参数的 Kaplan-Meier 方法包括 TTE、MST 和 TGD%。 P <0.05 被认为具有统计学意义。
数据和材料的可用性
支持本文结论的所有数据均包含在本文中。
缩写
- EpCAM:
-
上皮细胞粘附分子
- NDDS:
-
纳米给药系统
- DOX:
-
阿霉素
- EPR:
-
增强渗透性和滞留性
- ECM:
-
细胞外基质
- CSC:
-
癌症干细胞
- TIC:
-
肿瘤起始细胞
- MFI:
-
平均荧光强度
- MPS:
-
单核吞噬系统
- EDC:
-
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺
- NHS:
-
N-羟基琥珀酰亚胺
- PDI:
-
多分散指数
- DLS:
-
动态光散射仪
- FBS:
-
胎牛血清
- OD:
-
光密度
- AUC:
-
浓度-时间曲线下面积
- AUMC:
-
一阶矩曲线下面积
- t ½ :
-
半条命
- V d:
-
分发量
- 捷运:
-
平均停留时间
- Cl:
-
清关
- TTE:
-
到达终点的时间
- TGD:
-
肿瘤生长延迟百分比
- MST:
-
中位生存时间
- i.p.:
-
腹腔注射
- i.v.:
-
静脉注射
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