具有低强度聚焦超声诱导相变的姜黄素纳米颗粒作为卵巢癌的肿瘤靶向和 pH 敏感的治疗诊断纳米平台

介绍

卵巢癌是一种高度转移性和致死性的疾病，死亡率很高[1, 2]。由于早期临床症状不明显，多数患者确诊时肿瘤细胞已高度转移[3]。临床上常用的治疗方法是联合减瘤手术和化疗，晚期患者的5年生存率很低[4]。因此，迫切需要开发新的卵巢癌治疗和诊断策略以提高患者的总体生存率。最近，结合靶向治疗和影像诊断功能的纳米平台为有效治疗肿瘤提供了一种替代治疗策略[5,6,7]。

近年来，声响应纳米平台（ARN）已广泛应用于肿瘤治疗和诊断研究[8, 9]。 ARN 通常设计为微泡 (MB) 或纳米颗粒 (NP) 模型 [10,11,12]。与MBs相比，NPs具有更小的粒径、更高的渗透性、更长的药代动力学周期、更好的稳定性和更容易的表面改性能力[13]。不同种类的可相变液态碳氟化合物，例如全氟戊烷 (PFP​​)、全氟己烷 (PFH) 和全氟辛基溴 (PFOB)，通常用于实现声学响应 [14,15,16,17,18,19]。在外部聚焦超声刺激下，这些液态碳氟化合物可以通过声学液滴汽化 (ADV) 效应产生气泡，甚至爆裂。该过程为 ARN 提供了增强的超声对比能力。在这些液态碳氟化合物中，PFP沸点低（29.2℃），在体内容易气化，导致气体栓塞； PFOB 具有非常高的沸点 (144 °C)，需要超高强度的超声波来触发液-汽相变化。因此，PFH 被认为是理想的相变材料，沸点为 56 °C。然而，PFH 是疏水性的，最好将其封装在纳米颗粒中以使其溶于水。目前，已经报道了各种材料，如脂质体、PLGA、有机介孔、有机聚合物等，用于封装液体碳氟化合物[20,21,22,23,24]。同时，这些载体可以装载抗癌药物，使ARN具有化疗功能，并表现出声控释药能力[16, 19]。尽管据报道这些声响应纳米平台表现出良好的肿瘤诊断和治疗整合能力，但纳米载体的生物相容性仍然是临床转化的一个问题。近年来，无铁铁蛋白纳米笼已被广泛用作药物递送载体，因为它们是内源性蛋白质并且具有显着的 pH 敏感性 [25,26,27]。它们可以在酸性环境中分解，在碱性环境中重新组装。这使得铁蛋白具有高度的生物相容性，并为其提供可控的载药和释药能力。

本研究以铁蛋白为载体，同时加载PFH和姜黄素（Cur），并修饰蛋白质表面的肿瘤特异性靶向分子FA，获得多功能纳米平台（FA-FCP）。姜黄素是一种天然多酚，从姜黄中提取，据报道具有良好的抗癌作用；然而，其水溶性较差 [28,29,30,31]。 FA-FCP提高了PFH和Cur的水溶性，在不同介质中具有较高的生理稳定性，在体内外具有良好的生物相容性和生物安全性。在LIFU条件下，pH=5.0，FA-FCP在24 h内释放大量药物（53.2%）。 LIFU (7 W) 处理 4 分钟后，pH =5.0 的 FA-FCP 提供对比度增强的超声成像。由于 FA 受体介导的内吞作用，FA-FCP 可以很容易地进入细胞并在溶酶体中重新定位。注射 FA-FCP 后 18 小时，LIFU 刺激肿瘤部位，肿瘤显示超声造影成像。体内外实验表明FA-FCP对肿瘤治疗有显着效果。这些结果表明，FA-FCP具有非侵入性、配体/受体介导的靶向、LIFU触发的相变甚至爆破以及精确的药物释放等优势，使其成为一种很有前景的肿瘤治疗纳米平台。

材料和方法

材料

铁蛋白 (FRT)、叶酸 (FA) 和全氟己烷 (PFH) 购自 Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。姜黄素（Cur）购自阿拉丁工业公司（中国上海）。 NH2-PEG2000-FA 和 NH2-PEG2000-COOH 由西安瑞熙生物技术有限公司（中国）提供。 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺 (EDC) 和 N -羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)。 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 购自 Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)。 Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素-链霉素、胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清(FBS)购自Gibco (Grand Island, NY, USA)。

FA-FCP 的准备

为了制备FA-FCP，首先将10 mg FRT溶解在10 ml水中。将总共​​ 10 mg Cur 溶解在 0.3 ml DMSO 中。将两种溶液和1 ml PFH在pH 5.0条件下混合，冰浴超声30分钟。之后，将混合物的pH值调节至7.4以获得Cur和PFH负载的FRT（FCP）。其次，目标分子FA通过碳二亚胺法与FCP共价结合[8]。简而言之，在 EDC (5 mg/ml) 和 NHS (20 mg/ml) 存在下，将 5 mg NH2-PEG2000-FA 添加到上述 FCP 溶液中。在室温下轻微搅拌反应 3 小时后，混合物通过蒸馏水透析（MW 截止值 =12 kDa）24 h 纯化，得到 FA 偶联的 FCP（FA-FCP）。 Cur负载率由紫外-可见分光光度计在426 nm处检测并计算为（Aa-Ab）/Ac，其中Aa、Ab和Ac代表FA-FCP、FA-FP和FA-FP的重量，分别。

特征

通过 Zeta Sizer（Malvern，NanoZS，UK）测试纳米颗粒的尺寸和 zeta 电位。通过透射电子显微镜（TEM，Hitachi，Japan）和原子力显微镜（AFM，Agilent Technologies 5500LS，Chandler，Arizona）观察纳米颗粒的形态。通过共聚焦激光扫描显微镜（LEXT OLS4100，Olympus，Japan）和流式细胞术（BD，Franklin Lakes，NJ）检测纳米颗粒的细胞摄取。吸收光谱由紫外-可见分光光度计（UV1800，Shimadzu，Japan）获得。

细胞培养和动物模型

人卵巢癌细胞系SK-OV-3由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中，5% CO2，37 ℃培养。

Balb/c 裸鼠（雌性，约 5 周）由 Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（中国北京）提供。对于 SK-OV-3 肿瘤模型，1 × 10 ⁶ 细胞皮下注射到小鼠的右背部区域。所有实验程序均按照四川省医学科学院实验动物护理和使用指南进行，并经四川省医学科学院伦理委员会批准。

pH/LIFU 触发电流释放

FA-FCP水溶液被分成四份并装入透析袋(MW 5000)中。然后将它们透析到 10 ml 的 pH 值分别为 5.0 和 7.4 的 PBS 溶液中。 3 小时后，水溶液用或不用LIFU（7 W，5 分钟）处理（50%占空比，脉冲波模式和以下程序保持一致）。在特定时间点，移出 1 ml 透析液并加入等体积和等 pH 的空白溶液。取出透析液，用紫外-可见分光光度计测定，计算Cur浓度。

FA-FCP的ADV属性和US成像功能

pH =5.0 和 7.4 条件下的 FA-FCP 在琼脂糖凝胶模型中用不同功率的 LIFU（5、6、7 W）和不同的总时间（3、4 和 5 min）照射，然后 US 图像由美国设备（Esaote Mylab 90，意大利）观察到，频率为 5-12 MHz，机械指数（MI）为 0.06。用ImageJ软件分析US图像中感兴趣区域的US强度。

FA-FCP的定位能力

为了在体外证明 FA-FCP 的靶向能力，使用 FITC 标记纳米颗粒。简而言之，将 1 mg FITC 溶解在 1 ml DMSO 中，然后在温和搅拌下与 FCP 和 FA-FCP 混合 30 分钟。然后，将混合溶液在去离子水中透析过夜以去除游离的FITC和DMSO以获得FITC标记的纳米颗粒。将细胞培养24 h，然后将FITC标记的纳米颗粒加入培养板中孵育3h。然后用PBS洗涤细胞3次，然后用DAPI染色5 min，lysotracker red染色10 min，用4%多聚甲醛固定15 min。最后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。流式细胞仪对细胞内的统计荧光信号进行测量和分析。

FA-FCP 的血液循环和肿瘤蓄积

将游离的 Cur 和 FA-FCP（具有相同浓度的 Cur）静脉注射到正常小鼠体内。然后，在不同时间点从眼眶丛中收集各组小鼠的血液并溶解在裂解缓冲液中。这些治疗组血液中的 Cur 浓度由每个溶解血样的 Cur 吸收光谱使用紫外-可见分光光度计确定，并定义为每克组织注射剂量的百分比 (ID%/g)。

FA-FCP在肿瘤中的含量在荷瘤小鼠身上进行。 FA-FCP静脉注射0、1、6、12、18、24 h后，收集肿瘤组织，称重，王水消化24 h。这些治疗组血液中的Cur浓度由UV-Vis光谱仪通过每个溶解的肿瘤组织的Cur吸收光谱确定，并定义为每克组织注射剂量的百分比（ID％/g）。

体外和体内抗癌功效

对于体外抗癌效果，将细胞分别用PBS、Cur、FA-FCP、FCP+LIFU和FA-FCP+LIFU（相同的Cur剂量5 mg/kg）处理3 h​​，然后用LIFU照射（ 5 分钟，7 W）。处理过的细胞再温育21 小时。之后，通过CCK-8法检测处理细胞的活力。

对于体内抗癌效果，荷瘤小鼠随机分为五组（n =6)，然后分别静脉注射生理盐水（对照）、游离 Cur、FA-FCP、FCP + LIFU 和 FA-FCP + LIFU。在治疗的24 天期间，每3 天监测小鼠的肿瘤体积和体重。用卡尺检测肿瘤的大小。肿瘤体积=长×宽 ² /2。肿瘤生长变化以相对肿瘤体积表示，计算为V/V0，其中V0代表初始肿瘤体积。

生物安全评估

SK-OV-3细胞以1×10 ⁴ 的密度接种于96孔板中 细胞/孔，并允许附着 24 h。将各种浓度（0、20、40、100、200 和 500 μg/ml）的 FA-FRT-PFH 与 SK-OV-3 细胞一起培养。处理 24 小时后，将细胞用含有 10% CCK-8 的 DMEM 培养基在培养箱中处理 20 分钟。通过多模式读板机（Thermo Scientific）检测细胞在 450 nm 波长处的吸光度，以表征细胞活力。此外，在注射FA-FCP后25 天，收集健康小鼠的主要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，并通过苏木精和伊红染色进行分析。用光学显微镜观察HE染色图像。

统计分析

所有数据均表示为平均值±标准偏差。统计数据采用SPSS 22.0软件处理。学生的t 进行检验以确定两组之间的统计显着性。 P <0.05 表示差异显着。

结果与讨论

FA-FCP 的制备和表征

方案1说明了FA-FCP的合成及其在体外和体内肿瘤超声（US）成像和联合US化疗中的应用。 通过简单且具有生物相容性的自组装方法制备了多功能治疗诊断剂 FA-FCP。 FA-FCP 的 TEM 和 AFM 图像显示球形结构（图 1a，插图和附加文件 1：图 S1）。 DLS 分析表明，FA-FCP 的平均直径约为 47 nm，水中的平均 zeta 电位约为 -37 mV（图 1a 和 b）。在水中、磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、盐水和 FBS 中放置 4 周后，FA-FCP 显示出大小稳定（图 1c），表明制备的 FA-FCP 具有良好的生理稳定性，可能是由于 PEG 涂层和FRT 的性质 [32]。 FA-FCP 的 UV-vis-NIR 光谱显示出 Cur 的吸收峰，表明 FA-FCP 中存在 Cur。 Cur负载率为125.8±2.1%。

FA-FCP的组装方法、合成过程及诊疗应用示意图。

FA-FCP 的表征。 一 FA-FCP 的尺寸分布。插图是 FA-FCP 的 TEM 图像。 b FA-FCP 的 Zeta 电位。 c FA-FCP 在水、磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、盐水和胎牛血清 (FBS) 中在 28 天后的大小变化。 d 游离Cur(50 μg/ml)和FA-FCP(40 μg/ml)的UV-Vis-NIR吸收曲线。

图 2 显示了在有或没有 LIFU 的不同 pH 条件下 FA-FCP 的 Cur 释放曲线。在没有 LIFU 照射的情况下，24 h 内在 pH =5.0 时释放的 Cur 约为 30%，明显高于 pH =7.4 (5.3%)。然而，在 LIFU (7 W, 4 min) 下，在 pH =5.0 和 pH =7.4 条件下释放的 Cur 显示出急剧增加。然而，与在 pH =7.4 时释放的 Cur 相比，在 pH =5.0 (50%) 时释放的 Cur 明显高于 24 h。这一特性使 FA-FCP 在肿瘤微环境中非常有用。优异的药物释放归因于（1）酸性条件下的FRT可以分解并打开纳米笼以释放负载的Cur； (2) LIFU引起瞬时相变，使Cur稳定地从膨胀的多孔壳中逸出。

FA-FCP 在 PBS (pH =5.0/7.4) 中的药物累积释放，37 °C，有或没有 LIFU，3 小时后。 **p <0.01，与其他组相比

FA-FCP 的体外 ADV 效应

将 FA-FCP 分别暴露于功率为 5、6 和 7 W 的 LIFU，持续时间为 3-5 min，pH =7.4 或 5.0，以评估功率和 LIFU 持续时间和 pH 值的最佳条件. US 强度代表 ADV 效应。根据 US 图像（图 3a 和 b）和 US 图像中的平均灰度值（图 3c 和 d），ADV 效应在 pH =7.4 时表现出时间/功率依赖性趋势，在参数 7 W 处达到峰值5 分钟。然而，在 pH =5.0 时，ADV 效应在参数 7 W 时达到峰值，持续时间为 4 分钟。当参数低于 5 W 持续 3 min 时，触发气泡不足以优化 US 图像；然而，一旦参数超过 7 W 持续 4 min，大部分产生的气泡就会坍塌并逐渐消失。以上结果表明，一定的刺激是激发FA-FCP的ADV效应所必需的，即在pH=5.0时，功率为7-W，持续时间为4-min。

一 和 b FA-FCP 与琼脂糖凝胶混合在不同持续时间和 LIFU 功率下的 US 图像，pH 5.0/7.4。 c 和 d 图3a和b中US信号对应的统计数据

FA-FCP 的定位能力

经典的小分子染料 FITC 用于标记纳米颗粒。如附加文件1：图S2，FITC标记的FCP和FA-FCP在相同浓度下的荧光强度无显着差异，说明FCP和FA-FCP标记的FITC量差异不会影响细胞吸收实验。荧光图像和 FCM 分析表明，一些 FCP 可以以 19.5% 的摄取率进入细胞（图 4a 和 b），可能是因为细胞表面有一些促进 FCP 内化的铁蛋白受体。与 FA 结合后，FA-FCP 在细胞中显示出高荧光信号，摄取率为 44.3%，当细胞用游离 FA 预处理时，摄取率下降（13.8%）（图 4a 和 b）。以上结果表明，FA结合通过FA受体介导的内吞作用大大增加了FA-FCP的摄取率。

一 用游离 FITC 和 FITC 标记的 FCP、FA-FCP + FA 和 FA-FCP 处理的细胞的共聚焦荧光图像。绿色和蓝色分别代表 FITC 和 DAPI 荧光。比例尺 =60 um。 b 用游离 FITC 和 FITC 标记的 FCP、FA-FCP + FA 和 FA-FCP 通过 FCM 处理的细胞内 FITC 荧光信号统计数据。 **p <0.01，与其他组相比。 c 用 FITC 标记的 FA-FCP 和溶血追踪剂红处理的细胞的共聚焦荧光图像。绿色、蓝色和黄色分别代表 FITC、DAPI 和绿色/蓝色合并荧光。比例尺 =60 um

此外，使用溶酶体特异性染色染料（Lyso-Tracker Red）研究了 FA-FCP 的细胞器定位。如图 4c 所示，FA-FCP 和 Lyso-Tracker Red 处理的细胞分别在细胞质中表现出强烈的绿色和红色荧光。绿色和红色融合后，细胞质中可见强烈的黄色荧光，表明FA-FCP可以迁移到溶酶体（pH≈5.0），有利于触发细胞内药物的释放。

FA-FCP 的血液循环和肿瘤蓄积

如图 5a 所示，与游离 Cur 相比，FA-FCP 的半衰期约为 7.31 h（增加 8 倍），这可能是由于 PEG 涂层和 FRT 封装。血流中 FA-FCP 的这种延长的半衰期有利于改善药物在体循环中的滞留，促进药物在肿瘤部位的积累 [32, 33]。此外，注射纳米颗粒后 0 h 至 24 h 肿瘤中游离 Cur 和 FA-FCP 的动态积累如图 5b 所示。可以看出，FA-FCP 在注射后 18 h 的积累最高，游离 Cur 在注射后约 1 h 的积累最高。这些结果表明，与游离 Cur 相比，FA-FCP 在肿瘤组织中具有显着更高的蓄积性能，这可能是由于增强的渗透性和保留 (EPR) 以及 FA 受体介导的主动靶向作用 [34, 35]。

一 注射到小鼠体内后游离 Cur 和 FA-FCP 的血液循环。 b 注射荷瘤小鼠后肿瘤组织中游离Cur和FA-FCP的含量。 **p <0.01，与其他组相比

美国体内成像

分别观察4组（空白对照+LIFU、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU、FA-FCP无LIFU）处理的裸鼠肿瘤，观察是否暴露于LIFU（7 W，4 min）以进一步探索FA-FCP 在体内的 ADV 潜力。如图6a所示，对照组在LIFU照射下肿瘤内部未观察到明显的US信号。在注射后 18 h 时，与 FCP + LIFU 和 FA-FCP 没有 LIFU 的组相比，FA-FCP + LIFU 组在肿瘤内部观察到明显更强的 US 信号（图 6a 和 b）。结果表明FA-FCP+LIFU可以增强肿瘤的US成像对比度。

一 分别为对照 + LIFU、FCP + LIFU、FA-FCP + LIFU 和 FA-FCP 无 LIFU 组中肿瘤的 US 图像。 b 不同组肿瘤部位超声图像的定量平均灰度值。 **p <0.01，与其他组相比

体外和体内抗癌治疗

通过CCK-8测定研究FA-FCP的体外细胞毒性。如图 7a 所示，所有组的细胞活力都显示出 Cur 浓度依赖性模式。在没有 LIFU 的情况下，与游离 Cur 相比，FA-FCP 在所有浓度下都显示出更高的细胞活力抑制作用，这可能是由于 FA 靶向效应。然而，FA-FCP + LIFU 的细胞活力抑制显着高于 FP + LIFU、FCP + LIFU 和没有 LIFU 的 FA-FCP，表明 FA-FCP 联合 LIFU 照射提供了更好的抗肿瘤效率。这一结果主要是由于LIFU的存在和溶酶体的酸性环境，两者都可以诱导药物释放和空化作用，以及FA介导的肿瘤细胞靶向作用[36,37,38]。

一 SK-OV-3 细胞与不同浓度的 Cur、FP + LIFU、FA-FCP、FCP + LIFU 和 FA-FCP + LIFU 孵育的细胞活力。 b 对照、Cur、FP + LIFU、FA-FCP、FCP + LIFU和FA-FCP + LIFU组荷瘤裸鼠的相对肿瘤体积。 **p <0.01，与其他组相比。 c 对照组、Cur、FP+LIFU、FA-FCP、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU组荷瘤裸鼠治疗后肿瘤重量。 **p <0.01，与其他组相比。 d 对照组、Cur、FP + LIFU、FA-FCP、FCP + LIFU、FA-FCP + LIFU组荷瘤裸鼠的体重。

用荷瘤裸鼠进一步研究了 FA-FCP 的体内抗癌作用。根据FA-FCP的肿瘤蓄积结果，从第一天开始，每2 天静脉注射样品后18 h进行LIFU，共3次。如图7b和c所示，在治疗24 天后，FA-FCP+LIFU组的相对肿瘤体积与对照组、Cur、FA-FCP、FP+LIFU和FCP+LIFU组相比显着减小。 FA-FCP和FCP + LIFU组的肿瘤重量显着小于对照组和Cur组，而FA-FCP + LIFU组的抑制程度更高。在治疗期间，这些组的体重没有显着下降（图 7d）。 FA-FCP 联合 LIFU 的出色抗肿瘤作用主要是由于 FA-FCP 在肿瘤中的靶向聚集和声学/pH 响应性药物释放能力 [39,40,41]。此外，FA-FCP + LIFU 的这种增强的抗肿瘤治疗效果可能是由于 FA-FCP 在血流中的半衰期延长而导致纳米颗粒在肿瘤部位的清除延迟 [42]。

体外和体内生物相容性

通过 CCK-8 测定和 H&E 染色分析评估 FA-FCP 的体外和体内生物相容性。如图 8a 和 b 所示，载药 FA-FP 的细胞活力和 LIFU 功率从 0 到 8 W 均> 90%，表明 FA-FP 没有显着的细胞毒性和所用 LIFU 的功率在这项体外工作中。图 8c 显示了用 FA-FCP + LIFU 处理的小鼠主要器官的 H&E 染色图像，与对照组相比没有显示组织学变化。这些结果证明了FA-FCP在体外和体内的高生物相容性。

一 SK-OV-3 细胞与 FA-FP 孵育 24 h 后的细胞活力。 b 不同功率LIFU处理后SK-OV-3细胞的细胞活力。 c 纳米粒静脉注射后24 天对照组和FA-FCP组主要器官H&E染色(×200)

结论

总之，我们使用铁蛋白纳米笼制备了一种多功能 FA-FCP，其中装载了抗癌药物 Cur 和肿瘤靶向分子 FA，从而在化疗过程中实现了对比度增强的 US 成像能力和精确靶向。新合成的 FA-FCP 显示出很高的体外和体内生物相容性。此外，FA-FCP 表现出极好的肿瘤靶向能力、声学/pH 触发的 Cur 释放以及 LIFU 用于超声成像的声学响应相变。鉴于 FA-FCP 的这些独特特性，它可以作为一种重要的肿瘤抑制因子而没有全身毒性。预计这种新型且具有生物相容性的治疗诊断纳米平台将整合超声成像和提高治疗效果，为癌症治疗提供一个有前景的范例。

数据和材料的可用性

本手稿的结论是基于本文提供和展示的数据（正文和图表）

缩写

美国：

超声

FA：

叶酸

FRT：

铁蛋白

PFH：

全氟己烷

LIFU：

低强度聚焦超声

ADV：

声学液滴汽化

FITC：

异硫氰酸荧光素

CCK-8：

Cell Counting Kit-8

FBS：

胎牛血清

EDC：

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺

NHS：

N -羟基琥珀酰亚胺

当前：

姜黄素