PD-L1 单克隆抗体修饰的载有紫杉醇和 P-gp 转运抑制剂的纳米脂质体，用于协同化疗对抗多药耐药胃癌

介绍

目前基于单一药物方案的化疗远非完美，在较高剂量下会出现严重的不良反应，同时导致耐药性的发展[1]。过去十年见证了联合用药方案在癌症治疗中的高疗效[2]。由于组合药物的不同药理作用，两种或多种药物的组合已被证明可产生协同抗癌功效 [3, 4]。然而，选择正确的药物组合取决于多种因素，包括癌细胞类型、亲水/疏水药物、生化活性和药物的药代动力学模式。其中，联合用药对特定类型的癌症具有选择性[5]。

胃癌是全球健康负担，也是全球癌症相关死亡的第二大常见原因。日本、韩国和中国等东亚地区胃癌的患病率很高，而中国是世界上死亡率最高的国家[6]。中国平均每年登记 400,000 例新病例，大多数病例在晚期/晚期被诊断出[7, 8]。治疗策略取得了巨大进展；然而，它并没有提高存活率并导致治疗失败。治疗失败主要归因于化疗剂量的化疗耐药性和严重毒性的发展以及胃癌发作的复发[9]。因此，提高胃癌的治疗效果，克服胃癌的转移和复发是当务之急。

紫杉醇(PTX)是胃癌治疗中的重要药物之一[10]。 PTX 通过干扰微管的降解来抑制细胞复制，从而导致细胞周期停滞。然而，获得多药耐药性 (MDR) 是化疗成功之间的主要障碍 [11, 12]。由 ATP 结合盒 (ABC) 家族的跨膜转运蛋白介导的 ATP 依赖性流出，其中 p-糖蛋白 (p-gp) 被认为是丰富的因子，在胃癌中过度表达 [13]。换句话说，PTX 作为 p-gp 受体的底物，其中药物流出会降低细胞内药物浓度，导致低疗效和高耐药性 [14]。在这方面，Tariquidar (TQD) 是一种有效的第三代 p-gp 抑制剂，据报道可以逆转多种癌细胞中 p-gp 受体的过度表达 [15, 16]。然而，报告建议必须尽早终止 TQD 给药，因为它会阻碍正常生理系统的 p-gp 功能。 P-gp 表达是维持血脑屏障 (BBB) 和从正常组织中清除毒素所必需的 [17]。由于 p-gp 存在于正常组织中并充当细胞毒素的屏障，因此非特异性抑制 PTX 或 TQD 可能会干扰正常的生理功能并导致不良毒性。此外，PTX和TQD是高度亲脂性的药物，在水溶液和全身血液中的溶解度有限，需要一种稳定的靶向胃癌的给药系统[18]。

药物递送系统 (DDS) 显着增加了癌组织中包封药物的浓度，并提供了长时间持续释放的药物 [19]。在这方面，脂质体是一种广泛使用的药物载体，可以提高癌症的治疗效果。由于其生物相容性、结构表面修饰、亲水性/亲脂性药物负载和高药物负载能力，脂质体变得越来越重要[20]。药物可以稳定地掺入脂质体的脂质双层中，并通过增强渗透和保留（EPR）效应轻松赋予长循环能力（聚乙二醇化）[21]。最近，据报道脂质体能够在静脉给药后保持多种药物的比例[22]。这一想法在 2017 年获得 FDA 批准后得到证实，Vyxeos®（脂质体制剂）含有阿糖胞苷：柔红霉素的比例用于治疗白血病 [23]。与非靶向制剂相比，配体靶向制剂非常有吸引力和前瞻性。在这方面，PD-1 是一种细胞表面受体，以下调免疫系统和抑制 T 细胞炎症活动而闻名。据报道，50% 的胃癌患者表达了 PD-L1，使 PD-L1 作为纳米颗粒内化的靶向受体 [24, 25]。 PD-L1单克隆抗体（mAb）可以特异性结合PD-L1蛋白的胞外结构域，是提高抗癌疗效的优良治疗策略[26]。

本研究的主要目的是改善联合药物、PTX 和 TQD 的递送，以提高对胃癌的抗癌功效。为此，配制了 PTX 和 TQD 负载的 PD-L1/纳米脂质体，并评估了在体外和体内条件下的抗癌功效。在基于胃癌细胞的异种移植模型中评估体内疗效并进行免疫组织化学（IHC）。

结论

总之，我们的工作通过程序化递送策略实现了针对MDR肿瘤的联合治疗。我们已经证明了 PTX 和 p-gp 抑制剂 (TQD) 的组合在抑制多药耐药 SGC7901/ADR 异种移植肿瘤的肿瘤负荷方面的潜力。 PTX 和 TQD 在多功能纳米载体中的共同递送允许对共同加载的抗癌药物进行比例控制，抑制 p-gp 外排泵，并表现出协同抗癌功效。我们相信抗癌药物与p-gp抑制剂的联合应用可为耐药肿瘤的治疗提供潜在的方向。

材料和方法

PD-L1 mAb 偶联 PTX/TQD 纳米脂质体的制备

卵磷脂(EPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] ( DSPE-PEG) 和 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺 (DSPE-PEG2000-Mal) 与 PTX 和 TQD 以 3/2/0.5/0.25 的摩尔比混合在氯仿溶液中，然后使用旋转蒸发仪蒸发有机溶剂然后冷冻干燥 3 小时。脂质膜用维持在 pH 7.0 的 250 mM 硫酸铵溶液水合。将大的多层脂质体在保持在 65°C 的浴型超声仪（Branson 超声波浴，美国）中超声处理 30 分钟。脂质体在大量蒸馏水中透析严格 1 小时，以交换游离药物和初始成分。将脂质体重新分散在磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 中。 PD-L1 mAb 通过以 8:1（脂质体：mAb）比例混合并在 4°C 下孵育 4 小时与脂质体结合。 PD-L1 mAb 将通过脂质体 C 端马来酰亚胺基团抗体上的巯基残基之间的相互作用与 DSPE-PEG2000-Mal 偶联。将 PD-L1 偶联的脂质体以 10,000 rpm 的速度离心 10 分钟，去除上清液并重新分散在 PBS 缓冲液中，并储存在 4°C 中直至进一步分析。通过HPLC方法评估脂质体中包封的PTX和TQD的量。研究中使用了配备安捷伦科技自动进样器和 G1315D 二极管阵列检测器的 1260 Infinity 型安捷伦 HPLC 系统。流动相由乙腈/水 (70:30 v/v) 的混合物组成，流速保持在 1 ml/min。使用 C18 柱（5 μm，150 × 60 mm，ODS-3）洗脱样品并在 227 nm 处检测。在此之前，将载有PTX/TQD的脂质体溶于乙腈并涡旋15分钟，通过0.45 μm过滤器过滤，取10 μl等分试样注入HPLC柱。

粒度分布及颗粒形态分析

载药制剂的粒径分布和 zeta 电位由 Malvern zetasizer (UK) 在 25 °C 下测定。在实际实验之前，将纳米颗粒分散体用蒸馏水稀释 10 倍，并以 90° 的检测角以一式三份的方式进行实验。通过透射电子显微镜（TEM）评估纳米颗粒的形态。将纳米颗粒分散体用蒸馏水稀释 10 倍，放入涂碳的铜网格中，用红外灯干燥，然后用醋酸双氧铀染色后通过 TEM（CM 30，飞利浦（荷兰埃因霍温））评估样品(1% w/v)。

发布资料分析

通过透析方法评估了纳米脂质体中 PTX 和 TQD 的释放曲线。为此，将 15 mg PD-L1 mAb 偶联的 PTX 和 TQD 负载纳米脂质体 (PD-PTLP) 的冻干粉末溶解在 1 ml 蒸馏水中，并密封在透析膜 (MWCO 3.5 kDa) 中并浸入30 ml 各自的释放缓冲液保持在 37 °C。在预定时间，取出等分试样并替换为等量的释放缓冲液。研究持续72小时。样品经0.22 μm注射器过滤器过滤后注入HPLC柱，按上述方法评价。

细胞摄取研究

SGC7901/ADR 细胞在补充有 10% FBS 和 100 IU/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，在 5% CO2 气氛条件下，37°C。使用共聚焦激光扫描显微镜（BX61WI；Olympus，Tokyo，Japan）评估 SGC7901/ADR 细胞中 PTLP 和 PD-PTLP 的细胞分布和细胞摄取。为了达到这个目的，1 × 10 ⁵ 将细胞接种于 12 孔板的每孔中，培养 18 h。然后将细胞暴露于 PTLP 和 PD-PTLP 并孵育 3 小时。细胞用冷 PBS 洗涤 3 次，并用 4% 多聚甲醛 (PFA) 固定 10 分钟。细胞再次用 PBS 洗涤并用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色 10 分钟。最后，仔细洗涤细胞并在 CLSM 下观察。通过将游离的 PD-L1 mAb 预处理细胞 30 分钟并洗涤，进行 PD-PTLP 摄取的竞争性实验。细胞分为两组，一组用游离 PD-L1 mAb 处理，另一组未用游离 PD-L1 mAb 处理。将细胞与PD-PTLP孵育3 h后，按照相同方法进行细胞摄取分析。

蛋白质印迹分析的蛋白质表达

SGC7901/ADR细胞以3×10 ⁵ 的接种密度接种于6孔板 细胞/孔，孵育 18 小时。用不同的制剂（PTX、TQD、PTLP、PD-PTLP）处理细胞并孵育 24 小时。用剥离缓冲液洗涤和提取细胞，并使用标准裂解缓冲液（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）裂解细胞。将细胞以 12,000 rpm 的速度离心 15 分钟，收集上清液并使用 BCA 蛋白质测定（Beyotime）进行蛋白质定量。将等量的蛋白质加载到 8% SDS-PAGE 凝胶中，然后转移到硝酸纤维素膜（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）。用 5% 脱脂牛奶封闭膜 1 h 以抑制非特异性结合位点。将膜与一抗（p-gp 和 GAPDH，1:1000，Abcam，MA，USA）在 4°C 下孵育过夜。膜用 TBST 洗涤，并再次与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或小鼠抗体（兔或小鼠，1:10,000，Abcam，MA，USA）的二抗在室温下孵育。再次用TBST洗涤膜。在增强化学发光法（EMD Millipore）下观察印迹。

体外细胞毒性分析

通过 MTT 测定评估单个药物和制剂的细胞毒性作用。简而言之，癌细胞以 1 × 10 ⁴ 的密度分层 细胞/孔在 96 孔板中并孵育 18 小时。然后将细胞分别用游离 PTX、TQD、PTLP 和 PD-PTLP 处理 24 小时。接下来，仔细洗涤细胞，加入15 μl 5 mg/ml MTT溶液，再孵育3小时，然后加入100 μl DMSO提取甲臜结晶。使用自动酶标仪在 570 nm 处测量所得吸光度。细胞活力通过测试组的 OD/对照的 OD × 100% 计算。组合指数由Calcusyn ^TM 评价 软件。所有实验一式三份进行。

体外细胞凋亡和活性氧分析

对于细胞凋亡测定，癌细胞以 2 × 10 ⁵ 的密度分层 细胞/孔在 12 孔板中并孵育 18 小时。然后将细胞分别用游离 PTX、TQD、PTLP 和 PD-PTLP 处理 24 小时。通过剥离和离心来提取细胞，并将沉淀物重新分散在 100 μl 结合缓冲液中。将细胞与 5 μl Annexin-V/FITC 和 2.5 μl PI 工作溶液的组合共染色并孵育 15 分钟。使用BD FACS Calibur（BD Biosciences，CA，USA）通过流式细胞仪分析染色的细胞。 Annexin-V和PI分别代表基于活细胞和死细胞结构成分的早期凋亡指标和晚期凋亡指标。

2,7-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 用作活性氧 (ROS) 分析的探针。对于定量分析，1 × 10 ⁴ 细胞/孔接种于 96 孔黑底培养板，培养 18 h。然后将细胞分别用游离 PTX、TQD、PTLP 和 PD-PTLP 处理 24 小时。用 PBS 缓冲液洗涤细胞，然后按照制造商的指导方针与 1 ml DCFH-DA 溶液一起孵育 30 分钟。随后裂解细胞并以 10,000 rpm 离心 15 分钟。将所得上清液转移到新的 96 孔板中，并使用自动酶标仪在 485 nm 处测量荧光。同时，以类似的方式处理单独的一组细胞，并使用荧光显微镜（Nikon A1，Japan）观察图像。

PD-PTLP 在异种移植模型中的抗肿瘤功效

抗肿瘤功效研究在BALB/c裸鼠中进行，来自哈尔滨医科大学第四附属医院实验动物中心，哈尔滨。所有动物实验均按照国家实验动物质量标准进行。实验严格按照哈尔滨医科大学附属第四医院《实验动物委员会条例》的指导方针进行。动物皮下注射1×10 ⁶ SGC7901/ADR 细胞在 150 μl 培养基中，位于小鼠右侧。允许肿瘤生长至 100 mm ³ 在实际实验之前。将小鼠平均分为五组，每组八只。 PTX 和 TQD 的单独剂量固定为 5 mg/kg，而组合使用的总剂量为 5 mg/kg。尾静脉注射每三天一次，共注射3次。在预定的天数，测量肿瘤体积和体重。通过使用数显卡尺测量肿瘤的最长直径和最短直径来计算肿瘤体积。肿瘤体积 (V ) =½ × 长 × 宽 (mm) ² .在研究结束时处死小鼠，取出肿瘤并称重。对肿瘤进行免疫组织化学 (IHC) 分析。取出肿瘤，切成薄片，固定在10%福尔马林溶液中。将肿瘤包埋在石蜡中，然后按照制造商的指南进行 TUNEL 检测。

血清生化分析

给小鼠施用各自的制剂； 24 小时后，处死小鼠并从对照组和测试处理的动物组收集血液样本。将血清与全血分离并储存在 - 80 °C 中直至进一步分析。进行血清生化分析以评估肝脏的性能。测量天冬氨酸转氨酶 (AST) 和丙氨酸转氨酶 (ALT) 以评估肝功能。所有测量均按照生化试剂盒测定的程序进行。

结果与讨论

载有 PTX/TQD 的 PD-L1 偶联纳米脂质体的制备和表征

PTX已广泛应用于临床，主要用于治疗胃癌。然而，由于胃癌的多药耐药性（MDR），大多数患者显然治疗反应不佳。 PTX 剂量的增加导致全身毒性增加，从而 MDR 成为癌症治疗成功的主要障碍。在众多 MDR 机制中，p-gp 介导的药物外排被认为是导致癌细胞耐药的主要原因 [27]。因此，在本研究中，我们使用了第二种药物（TQD）作为 p-gp 抑制剂来克服癌细胞中的 MDR 现象并提高 PTX 的抗癌功效。我们仔细研究了表现出协同作用的两种药物的重量分数。为了最大限度地发挥抗癌作用，重要的是在单个纳米颗粒系统中共同递送多种药物。同时递送两种药物（PTX 和 p-gp 抑制剂）将允许有效抑制药物外排机制并增加癌细胞中细胞内浓度增加的前景 [28]。为此，在本研究中，我们在纳米脂质体的脂质双层中装载了两种药物，它们被认为在体循环中非常稳定（图 1）。为了实现增强的肿瘤特异性靶向，纳米脂质体与 PD-L1 mAb 表面偶联。纳米脂质体中存在的马来酰亚胺基团将与 PD-L1 mAb 的硫醇基团结合并形成稳定的共价键。但马来酰亚胺共轭的一个可能限制是反应是可逆的：产物可能会与血浆中的生物硫醇发生逆迈克尔加成反应，这可能导致马来酰亚胺的释放。然而，我们已经通过抗体在马来酰亚胺-脂质体上的最大表面缀合克服了这种反应。据报道，肿瘤靶向配体将特异性地递送肿瘤组织中的治疗负荷并避免正常组织中不必要的副作用。早些时候，帕特尔等人。据报道，p-gp 抑制剂与 PTX 的结合可以克服体外条件下卵巢癌细胞中的 MDR [11]。同样，邹等人。和张等人。据报道，在 Tariquidar 存在下，PTX 对 SKOV-3TR 和 A2780-Adr 多药耐药细胞的细胞毒性显着增加。然而，在这些研究中，要么使用了 PTX + TQD 的物理组合，要么开发了非靶向载体 [29, 30]。重要的是，所有这些研究仅在体外条件下进行。本研究的重点是使用一类相对较新的靶向剂 PDL1 抗体设计靶向纳米载体。此外，本研究证明了PTX + TQD在异种移植肿瘤模型中的疗效，并评估了与全身毒性相关的血液参数。

在 PD-L1 单克隆抗体 (mAb) 表面偶联的纳米脂质体中装载紫杉醇和他瑞奎达的示意图。脂质体通过脂质薄膜水合制备，超声处理形成载药纳米​​脂质体

PTLP 的平均粒径为 135.6 ± 1.26 nm，而在与 PD-L1 mAb (PD-PTLP) 缀合后增加至 168.59 ± 1.34 nm。由于PD-L1 mAb分子量大，粒径增大；尽管如此，整体尺寸小于 200 nm 和球形是值得注意的一点（图 2a）。由于增强的渗透和保留 (EPR) 效应，小于 200 nm 的纳米颗粒将允许在肿瘤组织中更高的积累。此外，PEG的存在将延长体循环中的血液循环时间。 PD-PTLP 的 zeta 电位为 22.1 ± 1.21 mV，不允许与血液成分发生任何非特异性结合。 PD-PTLP 对两种药物（PTX 和 TQD）均表现出~ 95% 的高包封率。 PD-PTLP 还表现出对 PTX 和 TQD 分别为 12-14% w/w 的高载药量（图 2b）。

负载 PTX/TQD 的 PD-L1 偶联纳米脂质体的物理化学表征。 一 使用透射电子显微镜 (TEM) 对 PD-PTLP 进行形态学分析。 b PD-PTLP 的载药量。 c 在 pH 7.4 缓冲液和 pH 5.0 缓冲液条件下，在 37 °C 下从 PD-PTLP 中体外释放 PTX 和 TQD。 **p <0.01 是 pH 7.4 和 pH 5.0 缓冲液在药物释放方面的统计学差异

体外药物释放

在 pH 7.4 和 pH 5.0 条件下，在 37 °C 下研究了 PTX 和 TQD 从 PD-PTLP 的释放行为。如图 2c 所示，在整个研究期间（72 小时）从 PD-PTLP 观察到药物（PTX 和 TQD）的受控释放。药物从纳米脂质体的厚双层释放可能是两种药物从 PD-PTLP 缓慢和持续释放的原因。必须指出的是，在 pH 7.4 和 pH 5.0 下，PTX 和 TQD 的释放模式没有观察到显着差异。在较长的时间点，在不同的 pH 条件下观察到的释放有显着差异。值得注意的是，纳米脂质体中没有添加 pH 响应元素，酸性条件下药物释放较高可能归因于较低 pH 下较高的扩散。例如，在 pH 5.0 条件下释放~ 85% 的 PTX，而在生理 pH 环境下释放~ 55% 的药物。其他研究人员已经证明了在酸性条件下小分子快速释放和在碱性 pH 条件下缓慢释放的类似模式。然而，在pH 7.4条件下相对较低的药物释放可能会减少不必要的全身副作用并延长体循环，而在pH 5.0条件下较高的药物释放可能有利于在肿瘤组织中获得更高的治疗效果。

体外细胞摄取分析

在 SGC7901/ADR 中测试了靶向 (PD-PTLP) 和非靶向 (PTLP) 纳米脂质体的递送效率。使用罗丹明-B 作为荧光跟踪器评估细胞摄取。罗丹明-B 是常用的荧光团，没有细胞生物相互作用。细胞核被蓝色 DAPI 染色，红色来自纳米颗粒。 CLSM 数据清楚地表明，与非靶向 PTLP 相比，PD-PTLP 在癌细胞中表现出强烈的红色荧光。 PD-PTLP 处理的癌细胞中较高的红色荧光归因于较高的纳米颗粒内化（图 3a）。 CLSM 数据的结果表明细胞膜上表达的 PD-L1 受体被偶联在纳米脂质体表面的 PD-L1 mAb 识别。在 PTLP 处理的癌细胞中，非特异性或被动摄取机制很明显。 PD-L1 靶向特异性通过 PD-L1 mAb 预处理实验得到进一步证实。 SGC7901/ADR 细胞用 PD-L1 mAb 预处理并孵育 30 分钟。然后将细胞暴露于 PD-PTLP 和 PTLP 并孵育 3 小时。如图所示（图 3b），与未处理的细胞相比，用 PD-L1 mAb 预处理的细胞显示出明显更少的红色荧光，表明 PD-L1 mAb 被表面表达的受体消耗，并且没有额外的受体可用于结合和内化导致较少吸收纳米颗粒和较少内化。这些CLSM清楚地揭示了PD-PTLP在SGC7901/ADR癌细胞中的靶向特异性。

一 SGC7901/ADR 细胞与 PTLP 和 PD-PTLP 孵育 3 小时后的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 图像； SGC7901/ADR 细胞在与 PD-PTLP 孵育 3 小时后用/不用 PD-L1 mAb 预处理的 CLSM 图像。使用罗丹明B作为荧光示踪剂，使用DAPI对癌细胞的细胞核进行染色

双载药纳米脂质体增强抗增殖作用

对于联合治疗，使用不同比例的两种药物（PTX 和 TQD）来确定对耐药胃癌细胞的协同或相加作用的程度。为了计算等效线图和组合指数 (CI)，使用了 CalcuSyn 软件（Biosoft，版本 2.1）。等值线图可以基于 Chou-Talalay 方程来解释。 CI 值的特点是协同 (CI <0.9)、相加 (CI =1) 和拮抗 (CI> 1)。如图所示，PTX 和 TQD 的所有组合比率显示 CI 值 <1，表示协同作用机制（图 4a）。具体而言，在 1/0.5 (P/T) 的重量分数下观察到最高的协同作用，而协同作用的水平随着 TQD 重量分数的增加而降低，表明两种药物在特定重量分数中存在的重要性。联合方案中的 TQD 浓度太低和太高都不会产生最佳的协同效应。对于所有的体外实验，我们在研究中使用了 P/T =1/0.5 的比率。

一 SGC7901/ADR 细胞中不同重量分数的 PTX 和 TQD 的组合指数 (CI)。组合指数由Calcusyn ^TM 评价 软件。 b 用不同浓度的游离 PTX、TQD、PTLP 和 PD-PTLP 处理 24 小时潜伏期后 SGC7901/ADR 细胞的体外细胞活力。 c 用相应制剂处理后 SGC7901/ADR 细胞中 p-gp 表达的蛋白质印迹分析。 **p <0.01 和 ***p <0.001为游离PTX与PD-PTLP治疗组的统计学差异

在孵育 24 小时后，通过 MTT 方案确定单个和组合药物的体外细胞毒作用。如图 4b 所示，空白 NP 对细胞活力没有任何影响，排除了对最终结果产生任何干扰的可能性。 PTX和TQD的单药治疗虽然在耐药胃癌细胞中显示出浓度依赖性的细胞毒作用；它没有达到明显的治疗效果。当与包裹在纳米脂质体中的第二种药物联合使用时，单药的抗增殖作用显着提高。 The combination of PTX and TQD resulted in obvious synergistic effect compared to that of individual drugs alone. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

一 Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. b Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. ***p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0.001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ , and ~ 650 mm ³ ， 分别。 Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0.001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; 一 tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. *p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; 一 mice body weight analysis; b , c blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. *p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章及其补充信息文件中。

缩写

EPR：

Enhanced permeation and retention effect

PD-PTLP:

PD-L1 mAb-conjugated PTX and TQD-loaded nanoliposomes

P-gp:

P-glycoprotein

PTLP:

PTX and TQD-loaded nanoliposomes

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar