靶向纳米脂质体共递送紫杉醇与 P-gp 抑制剂克服多药耐药胃癌

摘要

基于 ATP 依赖性外排转运蛋白 (P-糖蛋白, P-gp) 的多药耐药性 (MDR) 仍是化疗成功的主要障碍。本研究探讨了 PD-L1 单克隆抗体 (mAb) 偶联纳米脂质体作为靶向递送平台，共递送紫杉醇 (PTX) 和 P-gp 特异性转运抑制剂 (TQD, 塔利夸达) 治疗耐药胃癌。两种药物以精确比例共载于单一载体中，增强联合化疗效果。细胞摄取研究显示，PD-PTLP 在 PD-L1 受体过表达的 SGC7901/ADR 细胞中内化效率高于非靶向 PTLP。PTX/TQD 重量分数 1/0.5 时协同效应最强，联合用药较单药显著增强协同作用。体外实验表明 TQD 有效逆转 SGC7901/ADR 细胞多药耐药性。PD-PTLP 的 IC50 为 0.76 μg/ml，远低于 PTX (6.58 μg/ml) 和 TQD (7.64 μg/ml)。PD-PTLP 诱导的活性氧 (ROS) 水平和细胞凋亡显著高于游离 PTX 或 TQD。体内抗肿瘤研究显示，PD-PTLP 联合化疗显著抑制耐药异种移植瘤负担，末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 阳性细胞显著增加。游离 PTX 显著升高天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 和丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 水平，而 PD-PTLP 与对照组无显著差异，显示安全性优势。总体而言，抗癌药物与 P-gp 抑制剂联合递送为治疗耐药胃肿瘤提供潜在方向。

引言

单一药物方案的化疗远非完美，高剂量带来严重不良反应，同时导致耐药性产生。过去十年见证了联合用药方案在癌症治疗中的高疗效。两种或多种药物联合因药理作用不同可产生协同抗癌效果，但选择合适组合取决于癌细胞类型、药物亲疏水性、生化活性、药代动力学等多因素，且对特定癌症具有选择性。

胃癌是全球健康负担，是全球第二大癌症死亡原因。东亚 (日本、韩国、中国) 发病率高，中国死亡率居世界首位。中国每年新增约 40 万病例，多在晚期确诊。尽管治疗策略取得巨大进展，但未改善生存率，治疗失败主要归因于化疗耐药性、化疗剂量严重毒性及胃癌复发。因此，迫切需要提高治疗疗效、克服转移和复发。

紫杉醇 (PTX) 是胃癌治疗重要药物之一，通过干扰微管解聚抑制细胞复制导致细胞周期阻滞。然而，多药耐药 (MDR) 获得是化疗成功的主要障碍。ATP 结合盒 (ABC) 家族跨膜转运蛋白介导的 ATP 依赖性外排中，P-gp 为丰富因子，在胃癌中过表达。PTX 作为 P-gp 底物，药物外排降低细胞内药物浓度导致疗效低、耐药性高。塔利夸达 (TQD) 为强效第三代 P-gp 抑制剂，可逆转多种癌细胞 P-gp 过表达。但报道指出 TQD 给药需早期终止，因其阻碍正常生理系统 P-gp 功能。P-gp 维持血脑屏障 (BBB) 并清除正常组织毒素，非特异性抑制 PTX 或 TQD 可能干扰正常生理功能导致不良毒性。此外，PTX 和 TQD 高脂溶性、水溶性差，需稳定靶向胃癌的药物递送系统。

药物递送系统 (DDS) 显著增加包封药物在癌组织浓度，提供持续释放。脂质体因生物相容性、表面修饰灵活、亲疏水药物负载、高药物负载量成为癌症药物载体主流。药物稳定包裹在脂质体双分子层中，易通过 PEGylation 利用增强渗透滞留效应 (EPR) 实现长循环。近期脂质体被证实静脉给药后仍能保持多药比例，2017 年 FDA 批准 Vyxeos® (脂质体制剂) 含阿糖胞苷:柔红霉素比例治疗白血病即例证。相比非靶向制剂，配体靶向制剂更具吸引力。PD-1 为下调免疫系统、抑制 T 细胞炎症活性的细胞表面受体。PD-L1 在 50% 胃癌患者中表达，可作为纳米颗粒内化靶向受体。PD-L1 单克隆抗体可特异性结合 PD-L1 细胞外域，是改善抗癌疗效的优秀策略。

本研究旨在改善联合药物 PTX 和 TQD 递送以增强对胃癌抗癌疗效。为此制备 PTX 和 TQD 负载 PD-L1/纳米脂质体，在体外和体内条件下评估抗癌疗效。体内疗效在胃癌细胞异种移植模型评估，并进行免疫组化 (IHC) 分析。

材料与方法

PD-L1 mAb 偶联 PTX/TQD 负载纳米脂质体制备

卵磷脂 (EPC)、DOPE、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Mal 按摩尔比 3/2/0.5/0.25 溶于氯仿，加入 PTX 和 TQD，旋转蒸发除去有机溶剂后冻干 3 小时。脂质膜用 250 mM 硫酸铵溶液 (pH 7.0) 水化。大多层脂质体在 65 °C 水浴超声器中超声 30 分钟。透析袋 (MWCO 3.5 kDa) 透析纯水 1 小时去除游离药物和初始成分。脂质体重悬于磷酸缓冲液 (PBS, pH 7.4)。PD-L1 mAb 以 8:1 (脂质体:mAb) 比例混合孵育 4 小时 (4 °C)，通过抗体巯基与脂质体马来酰亚胺基反应共价偶联。离心 (10,000 rpm, 10 min) 去除上清，PBS 重悬储存 4 °C。高效液相色谱 (HPLC) 测定包封药物量：Agilent 1260 Infinity 系统，C18 色谱柱 (5 μm, 150×60 mm)，流动相乙腈/水 (70:30)，流速 1 ml/min，227 nm 检测。样品用乙腈溶解、涡旋 15 分钟、0.45 μm 滤膜过滤后进样。

粒径分布与形貌分析

Malvern Zetasizer (25 °C) 测定粒径分布和 Zeta 电位。纳米颗粒分散液 10 倍稀释，90° 散射角三次重复测量。透射电子显微镜 (TEM, Philips CM 30) 观察形貌：样品 10 倍稀释滴加碳膜铜网，红外灯干燥，醋酸铀 (1% w/v) 染色后观察。

释放曲线分析

透析法评估 PTX 和 TQD 从纳米脂质体释放行为。15 mg 冻干 PD-PTLP 溶于 1 ml 水，封入透析袋 (MWCO 3.5 kDa) 浸入 30 ml 释放缓冲液 (37 °C)。定时取样等量补液，持续 72 小时。0.22 μm 注射器滤膜过滤后 HPLC 分析。

细胞摄取研究

SGC7901/ADR 细胞培养于 DMEM (10% FBS, 100 IU/ml 青霉素, 100 μg/ml 链霉素, 5% CO₂, 37 °C)。共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM, Olympus BX61WI) 评估 PTLP 和 PD-PTLP 在细胞中分布与摄取。1×10⁵ 细胞/孔种于 12 孔板培养 18 小时，暴露于 PTLP 和 PD-PTLP 孵育 3 小时。冷 PBS 洗涤三次，4% 多聚甲醛 (PFA) 固定 10 分钟，PBS 洗涤后 DAPI 染色核 10 分钟，CLSM 观察。竞争实验：细胞用游离 PD-L1 mAb 预处理 30 分钟洗涤后分两组，一组处理游离 PD-L1 mAb，另一组不处理，随后孵育 PD-PTLP 3 小时，同法评估摄取。

Western Blot 蛋白表达分析

SGC7901/ADR 细胞接种 3×10⁵ 个/孔 (6 孔板) 培养 18 小时，处理不同制剂 (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) 24 小时。剥离缓冲液收集细胞，标准裂解缓冲液裂解，12,000 rpm 离心 15 分钟取上清，BCA 法定蛋白量。8% SDS-PAGE 电泳转印硝酸纤维素膜，5% 脱脂奶封闭 1 小时。一抗 (P-gp 和 GAPDH, 1:1000, Abcam) 4 °C 过夜，TBST 洗涤后二抗 (HRP 标记羊抗兔/鼠, 1:10,000, Abcam) 室温孵育，再洗膜，ECL 法显色。

体外细胞毒性分析

MTT 法评估单药及制剂细胞毒性。1×10⁴ 细胞/孔种于 96 孔板培养 18 小时，分别处理游离 PTX、TQD、PTLP、PD-PTLP 24 小时。洗涤后加 15 μl 5 mg/ml MTT 孵育 3 小时，加 100 μl DMSO 溶解甲晶，酶标仪 570 nm 吸光度。细胞活力 = 测试组 OD/对照组 OD × 100%。CalcuSyn 软件计算组合指数 (CI)。三次重复。

体外凋亡与 ROS 分析

凋亡分析：2×10⁵ 细胞/孔种于 12 孔板培养 18 小时，处理制剂 24 小时。剥离离心收集细胞，100 μl 结合缓冲液重悬，Annexin V-FITC (5 μl) 和 PI (2.5 μl) 共染 15 分钟，流式细胞仪 (BD FACS Calibur) 分析。Annexin V 为早期凋亡指标，PI 为晚期凋亡指标。ROS 分析：DCFH-DA 探针。1×10⁴ 细胞/孔种于 96 孔黑底板培养 18 小时，处理制剂 24 小时。PBS 洗涤后按说明书孵育 DCFH-DA 30 分钟，裂解离心 10,000 rpm 15 分钟，上清转移新 96 孔板，酶标仪 485 nm 测荧光。同步制备细胞荧光显微镜 (Nikon A1) 观察。

异种移植模型抗肿瘤疗效

BALB/c 裸鼠 (哈尔滨医科大学第四附属医院实验动物中心) 皮下接种 1×10⁶ SGC7901/ADR 细胞 (150 μl 培养基) 于右侧侧胁。肿瘤长至 100 mm³ 开始实验。等分五组每组 8 只。PTX 和 TQD 单药剂量固定 5 mg/kg，联合用药总剂量 5 mg/kg。尾静脉注射每 3 天一次，共 3 次。定期测量肿瘤体积 (数字游标卡尺测最长和最短直径，V = ½ × 长 × 宽²) 和体重。实验结束处死取瘤称重。瘤组织 10% 福尔马林固定、石蜡包埋、TUNEL 检测 (按说明书)。

血清生化分析

给药 24 小时后处死取血，分离血清 -80 °C 保存。测定 AST、ALT 评估肝功能，按生化试剂盒操作。

结果与讨论

PTX/TQD 负载 PD-L1 偶联纳米脂质体制备表征

PTX 广泛用于胃癌临床，但多数患者因 MDR 疗效差。增加 PTX 剂量加剧全身毒性，MDR 成为癌症治疗主要障碍。P-gp 介导药物外排被认为是癌细胞耐药主要机制。本研究用 TQD 作为 P-gp 抑制剂克服 MDR，提高 PTX 疗效。仔细研究两药重量分数协同效应，为最大化抗癌效果，需单一纳米颗粒系统共递送多药。同时递送 PTX 和 P-gp 抑制剂可高效抑制药物外排机制，增加癌细胞内药物浓度。为此将两药负载于纳米脂质体脂质双层 (极稳定于体循环)，表面偶联 PD-L1 mAb 实现肿瘤靶向。马来酰亚胺基与抗体巯基形成稳定共价键。虽马来酰亚胺偶联可逆 (血浆生物巯基可能发生逆迈克尔加成释放马来酰亚胺)，但最大表面抗体偶联可克服此反应。文献报道肿瘤靶向配体可特异性递送治疗载荷至肿瘤组织，避免正常组织副作用。早期研究多在体外条件下用物理混合 PTX+TQD 或非靶向载体，本研究设计靶向纳米载体采用新型靶向剂 PD-L1 抗体，且在异种移植瘤模型验证疗效并评估血液参数关联全身毒性。

PTLP 平均粒径 135.6±1.26 nm，PD-L1 mAb 偶联后增至 168.59±1.34 nm (PD-PTLP)，因抗体大分子量，但整体 <200 nm 且球形，利于 EPR 效应肿瘤积聚。PEG 赋予长循环。PD-PTLP Zeta 电位 22.1±1.21 mV，避免非特异性血液成分结合。包封效率 ~95% (PTX 和 TQD)，药物负载量 12–14% w/w。

体外药物释放

pH 7.4 和 5.0 (37 °C) 下考察释放行为。PD-PTLP 在 72 小时内呈现 PTX 和 TQD 可控释放。纳米脂质体厚双分子层导致两药缓慢持续释放。pH 7.4 和 5.0 释放模式早期无显著差异，长时间点酸性条件下释放显著加快 (~85% PTX 在 pH 5.0 释放 vs ~55% 在生理 pH)。未添加 pH 响应元件，酸性加速释放可能归因于低 pH 扩散加快。生理 pH 低释放减少全身副作用、延长循环；肿瘤组织酸性微环境高释放有利疗效。

体外细胞摄取分析

以罗丹明 B 为荧光追踪评估靶向 (PD-PTLP) 和非靶向 (PTLP) 纳米脂质体在 SGC7901/ADR 中递送效率。CLSM 显示 PD-PTLP 处理细胞红色荧光强烈，非靶向 PTLP 较弱，表明靶向纳米颗粒内化更高。PD-L1 mAb 预处理实验证实靶向特异性：预处理游离 PD-L1 mAb 后细胞红色荧光显著降低，因表面受体被占满无法结合内化纳米颗粒。

双药负载纳米脂质体增强抗增殖效果

不同 PTX/TQD 重量比建立等效线图和组合指数 (CI)，CalcuSyn 软件计算。CI <0.9 协同，=1 叠加，>1 拮抗。所有比例 CI <1 显示协同机制 (图 4a)。最高协同在重量分数 1/0.5 (P/T)，TQD 比例增加协同降低，说明特定比例至关重要。体外实验均采用 P/T=1/0.5。

MTT 法测定 24 小时细胞毒性 (图 4b)。空白 NP 无影响。单药 PTX 和 TQD 虽呈浓度依赖性细胞毒性，但疗效有限。双药封装纳米脂质体显著增强抗增殖效果，协同明显。PD-PTLP 展现最强抗增殖效果，归因于 PD-L1 靶向配体提高细胞内化 (与摄取分析一致)。PD-PTLP IC50 0.76 μg/ml，远低于 PTX (6.58 μg/ml) 和 TQD (7.64 μg/ml)，十倍降低表明 TQD 逆转了 P-gp 过表达 SGC7901/ADR 对 PTX 的耐药。Western blot 显示 PTX 不影响 P-gp 表达，TQD 显著下调 P-gp，确认其抑制剂角色。PTLP 和 PD-PTLP 对 P-gp 表达影响与 TQD 组相近，证明单一纳米载体共载 PTX 和 TQD 的优势，与细胞活力结果吻合：PTX+TQD 逆转 MDR，增强抗癌疗效。

流式细胞术凋亡分析

Annexin V-FITC/PI 染色流式分析凋亡 (图 5a)。对照组无凋亡，游离 PTX 和 TQD 明显增加凋亡细胞。PTLP 凋亡比单药高约两倍，显示协同效应。PD-PTLP 凋亡率最高 (~60%)，归因于双药纳米载体高内化和比例协同潜力。TQD 在联合方案中沉默 P-gp 增强 PTX 抗癌效果。单药凋亡率 20–25%，PD-PTLP ~60%，表明 PD-L1 靶向更高效递送 PTX/TQD 诱导 SGC7901/ADR 凋亡。

细胞内 ROS 水平测定

DCFH-DA 探针 (绿色荧光) 评估 ROS 水平 (图 5b)。未处理细胞无 ROS，PTX 或 TQD 诱导一定 ROS。PTLP 和 PD-PTLP 触发显著更高 ROS，荧光显微镜图像显示 PD-PTLP 绿色荧光最亮、强度最高。高 ROS 暗示 PD-PTLP 促进更高凋亡。氧化应激 (ROS) 是细胞毒性重要指标，诱导 DNA 损伤、炎症、细胞凋亡等生理事件。

PTX 与 TQD 联合抑制耐药肿瘤生长

耐药 SGC7901/ADR 异种移植瘤模型评估疗效与毒性 (图 6a)。固定剂量 5 mg/kg 每 3 天静脉注射共 3 次，PTX/TQD 重量分数 1/0.5。游离 PTX 和 TQD 对 MDR 肿瘤生长无抑制，说明耐药细胞对增殖表现耐受。TQD 虽抑制药物外排泵但未转化为疗效改善。PTX+TQD (PTLP) 显著抑制耐药肿瘤生长。PD-PTLP 抗肿瘤疗效最佳：比对照组高 3 倍，比游离药组高 2.5 倍，比非靶向制剂约 2 倍 (p<0.05; p<0.001)。终末肿瘤体积：对照 ~2000 mm³，游离 PTX ~1650 mm³，TQD ~1625 mm³，PTLP ~1000 mm³，PD-PTLP ~650 mm³。游离药早期略有效但后期同对照。结果明确 PTX+P-gp 抑制剂联合策略有效控制肿瘤负担。PD-PTLP 广泛肿瘤抑制表明靶向制剂疗效更优。肿瘤重量与体积一致 (图 6b)，PD-PTLP 组肿瘤最小 (p<0.001)。TUNEL 分析 (图 6c) 显示 PD-PTLP 大面积凋亡染色，细胞排列紊乱，显著肿瘤杀伤效应。优异疗效主要归因于靶向配体 PD-L1 mAb 结合受体增加细胞内药物浓度，联合方案控释延长作用时间，致密亲水 PEG 表面冠提供物理稳定性、避免蛋白吸附和快速清除，长循环与纳米尺寸促进肿瘤组织积聚。

全身毒性分析

体重变化反映全身毒性 (图 7a)。游离 PTX 组第 10 天体重下降 ~20%，后逐渐恢复。体重下降 >5% 视为严重内脏毒性，20% 为显著不良反应。PTLP 和 PD-PTLP 无明显体重下降，小鼠全程健康，显示纳米脂质体安全性。血浆氨基转移酶 (AST、ALT) 水平进一步评估安全性 (图 7b、c)。游离 PTX 显著升高 AST 和 ALT (p<0.01)，PD-PTLP 和 PTLP 与对照组无显著差异。AST 释放于心、肾、肝损伤，ALT 特异性反映肝损伤。AST/ALT 水平作为器官损伤指标，PD-PTLP 显示为安全载体。

结论

本研究通过程序化递送策略实现针对 MDR 肿瘤的联合治疗。证明 PTX 与 P-gp 抑制剂 (TQD) 联合抑制多药耐药 SGC7901/ADR 异种移植瘤负担。多功能纳米载体共载 PTX 和 TQD 实现比例控制，抑制 P-gp 外排泵，展现协同抗癌疗效。抗癌药物与 P-gp 抑制剂联合为治疗耐药肿瘤提供潜在方向。

缩略语

EPR:

增强渗透滞留效应

PD-PTLP:

PD-L1 mAb 偶联 PTX 和 TQD 负载纳米脂质体

P-gp:

P-糖蛋白

PTLP:

PTX 和 TQD 负载纳米脂质体

PTX:

紫杉醇

TQD:

塔利夸达