微波辅助壳聚糖功能化氧化石墨烯作为可控的细胞内药物递送纳米系统，具有协同抗肿瘤活性

介绍

HER2 受体是 EGFR 受体家族的一员，介导癌细胞的生长和分化，在 20-30% 的人类乳腺癌中高度过表达，导致转移性肿瘤表型和不良预后[1]。大约 20% 的人类胃癌中也有 HER2 过表达 [2]。曲妥珠单抗是一种人源化单克隆治疗性抗体，作为 HER2 过表达乳腺癌患者的一线治疗显示出有希望的治疗优势 [3]。然而，曲妥珠单抗的总体反应率仍然适中：作为单一疗法治疗时为 15-30%，与化疗药物联合治疗时为 50-75% [4]。在那些对曲妥珠单抗有反应的患者中，他们中的大多数最终在初始反应后进展，并在持续治疗后逐渐获得耐药性 [5]。因此，为 HER2 过表达患者开发其他新疗法以提高总体生存率至关重要。

蒽环类药物仍然是癌症治疗的支柱。对于蒽环类药物，拓扑异构酶II抑制剂阿霉素已被广泛用于治疗多种癌症，如乳腺癌、肺癌和淋巴癌[6]。由于 HER2 基因和拓扑异构酶 II 基因之间的接近性，阿霉素在治疗 HER2 过表达的乳腺癌患者中具有有效的疗效 [7]。尽管在乳腺癌中使用基于蒽环类药物的疗法观察到临床益处，但心脏功能障碍限制了更广泛的治疗应用。在临床试验中，曲妥珠单抗联合阿霉素显示出显着疗效，而高剂量依赖性心脏毒性则是一个亟待解决的问题[8]。在癌症靶点组织持续释放化疗药物被认为是降低治疗效果所需剂量和提高安全性的良好解决方案[9]。为了获得更好的抗肿瘤效果和更少的副作用，迫切需要提高靶向癌细胞的抗癌药物递送效率。

基于氧化石墨烯 (GO) 的纳米材料在化疗药物的受控递送方面显示出巨大的前景 [10]。大量研究表明，GO 的毒性与其表面功能化有关 [11]。最近，据报道，环境友好的试剂，如壳聚糖和 PEG，可以用毒性较小的表面官能团对 GO 进行功能化 [12, 13]。纳米颗粒在生物介质中的胶体稳定性对于开发有效和安全的临床用药系统至关重要 [14]。由于其生物相容性和稳定性等特性，功能化的 GO 纳米片在生物医学应用中受到了极大的关注。作为石墨烯基生物材料的优秀候选者，GO 或 rGO 的胶体稳定性对于控制药物载体的性能很重要。聚（乙二醇）功能化的 GO 在细胞培养基中表现出改善的胶体特性 [15]。 P. Khanra 报道了一种通过使用酵母细胞作为还原性生物催化剂同时还原和生物功能化 GO 的新方法 [16, 17]。 Avinav G 提出了通过在高压釜过程中利用酵母提取物进行一锅法生物合成 [18]。对微米尺寸的 GO 片材进行数小时的超声处理会产生 GO 纳米片，与常规微米尺寸的 GO [19] 相比，它显示出更高的胶体稳定性。尽管之前的研究证明了 GO 在生物材料方面的巨大潜力，但直到现在还没有研究过使用无细胞酵母提取物通过微波辅助还原制备具有壳聚糖的生物功能化 GO 纳米片。为此，通过利用酵母提取物作为还原剂的简易微波合成系统构建了一种新型壳聚糖功能化氧化石墨烯（ChrGO）结构。此外，GO与生物相容性壳聚糖的有效功能化为有效的药物装载和递送提供了潜在的平台。药物加载和释放研究表明，阿霉素可以有效地加载到 ChrGO 纳米片上并从其释放。 ChrGO/阿霉素复合物以浓度依赖性方式显示出显着的抗肿瘤活性。特别是，与单一疗法相比，ChrGO/阿霉素和曲妥珠单抗的联合治疗导致 BT-474 细胞的生长抑制作用增强。这些药物的协同抗肿瘤功效被揭示是通过细胞周期停滞和细胞凋亡介导的，最终导致癌细胞死亡。这项工作报告了一条快速、经济地生产 ChrGO 复合材料的有前景的途径，该复合材料以时空控制的方式提供化疗药物以实现有效的癌症治疗（方案 1）。

微波辅助生物功能化和氧化石墨还原作为可控给药纳米系统在HER2过表达BT-474细胞中的双重靶向治疗

材料和方法

材料

石墨粉购自青岛华泰科技（中国青岛）。壳聚糖和阿霉素购自阿拉丁有限公司（中国上海）。曲妥珠单抗购自 Hoffmann-La Roche Ltd（瑞士巴塞尔）。 Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640)、Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 和胎牛血清 (FBS) 购自 Invitrogen Corporation (Camarillo, USA)。 Amicon ^® 超离心过滤器购自 Merck Millipore。 CellTiter 96 ^® 一种水溶液细胞增殖检测试剂盒和 Caspase-Glo ^® 3/7 检测系统试剂盒购自 Promega Corporation (Madison, USA)。干面包酵母来自 AB/Mauri Co., Ltd. BT-474 和 Cos-7 细胞系来自中国科学院细胞库（中国上海）。 Luria-Bertani培养基购自Sangon Biotech Co., Ltd.，所有化学品均为分析纯，无需进一步纯化即可商购。

微波辅助还原功能化的壳聚糖 GO

使用改进的 Hummer 方法 [14] 从天然石墨薄片制备氧化石墨 (GO)。为了获得单层纳米尺寸的 GO，使用在 800 W 下运行 8 小时的超声波探头（Scientz，中国）将 GO 剥离。最后，将剥落的 GO 分散在去离子水中以备进一步使用。部分还原的壳聚糖-GO（ChrGO）纳米片是通过使用微波合成系统用壳聚糖水溶液微波辅助还原GO来合成的。无细胞酵母提取物用于通过微波辅助还原生物合成 ChrGO。首先，通过接种到 Luria-Bertani 培养基中并在 25°C 下以 135 rpm 振荡 18 小时来激活储存的酵母细胞。将活化的酵母细胞转移到 2% 蔗糖溶液中，在 25°C 下以 135 rpm 再振荡 6 小时。接下来，通过在 2000 rpm 下离心分离 5 分钟获得 6 mL 无细胞酵母提取物。然后，将 50 毫克壳聚糖溶解在 25 毫升 2% (v/v) 乙酸溶液中，并与酵母提取物混合 [20]。在剧烈磁力搅拌下加入 5mg GO 溶液。最后，将制备好的溶液转移到 NOVA-2S 微波合成设备（中国普瑞科仪器）中进行微波反应。微波系统的加热方案包括加热至 80°C 5 分钟，然后再保持该温度 5 分钟。得到的ChrGO用100-kDa MWCO过滤器（美国密理博）纯化，冷冻干燥备用。

特征

在加速电压为 200 kV (JEOL, Japan) 的 JEM-2100 透射电子显微镜上获得纳米尺寸 GO 的透射电子显微镜 (TEM) 图像。使用 UV/Vis/NIR 分光光度计 Lambda 950（Perkin-Elmer，USA）获得紫外-可见（UV-Vis）光谱。通过使用 Vertex 70 FTIR 光谱仪从 4000 到 400 cm ^-1 扫描收集傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱 样品制备为 KBr 颗粒（Bruker，德国）。使用激发波长为 532 nm 的 Senterra R200-L 拉曼显微镜（Bruker Optics，Germany）记录拉曼光谱。通过 Bruker D8 Advance 衍射仪（Bruker，Germany）检查 X 射线衍射（XRD）图。使用 X 射线光电子能谱 (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD 和单色 Al Ka 辐射（1486.6 eV）（日本岛津制作所）记录表面元素。热重分析 (TGA) 在 PerkinElmer Pyris 1 TGA 上以 5°C/min 的加热速率在氮气气氛中从 30 到 800°C（PerkinElmer，美国）进行。复合材料的表面电荷由英国马尔文的Malvern Zeta Nano ZS-90仪器测量。

药物加载和释放

4 毫克 ChrGO 纳米颗粒悬浮在 20 毫升阿霉素水溶液 (0.4 毫克/毫升) 中。超声处理 0.5 小时后，避光避光搅拌 24 小时。通过 50-kDa MWCO Amicon 过滤器（Millipore，美国）离心过滤去除卸载的阿霉素，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 8.0）洗掉，直到上清液变成无色。使用 SpectraMax ^® 在 490 nm 处通过 UV-Vis 光谱法，使用标准阿霉素浓度曲线测定阿霉素浓度 M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）。通过测量 Amicon ^® 上清液中阿霉素损失的浓度，用 UV-Vis 吸光度确定 ChrGO 上阿霉素的负载量 超 15 mL 离心过滤器。

研究了 ChrGO 的阿霉素释放特性。将载有阿霉素的 ChrGO 浸入 10 mL PBS 缓冲溶液中。在指定的时间间隔，通过 50-kDa MWCO Amicon 过滤器（Millipore，美国）离心过滤收集从 ChrGO 分离的 2mL 释放的阿霉素溶液。 ChrGO/阿霉素溶液的体积通过在每次采样后添加 2 mL 新鲜的 PBS 缓冲溶液来保持恒定。 ChrGO 释放的阿霉素量通过 SpectraMax ^® 在 490 nm 处的 UV-Vis 吸光度测量 M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）。在不同pH值溶液(pH值5和7.4)中研究了释放研究。

生物相容性分析和治疗功效分析

BT-474 和 Cos-7 细胞分别维持在补充有 10% FBS 的 RPMI-1640 或补充有 10% FBS 的 DMEM 中，并在 5% CO 2 的潮湿气氛中在 37°C 下培养。通过细胞毒性测定对 BT-474 或 Cos-7 细胞进行 GO 和 ChrGO 的生物相容性测定。将细胞以3 × 10 ⁴ 的密度接种于96孔平板中 细胞每孔并在用 GO 和 ChrGO 处理前预孵育 18 小时。然后，将测试试剂的稀释液添加到细胞中并再孵育 24 小时。 CellTiter 96 ^® 测定细胞活力 水溶液。通过 SpectraMax ^® 在 490 nm 处测量吸光度 M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）。

ChrGO/阿霉素复合物单独或与曲妥珠单抗联合治疗对 BT-474 细胞增殖的功效通过增殖抑制试验进行研究 [16]。 BT-474细胞以1 × 10 ⁴ 的密度接种于96孔平板中 每孔细胞并孵育 24 小时。然后，将单独或与曲妥珠单抗联合处理的 ChrGO/阿霉素复合物引入培养基中的 BT-474 细胞。孵育96小时后，通过CellTiter 96 ^® 测定活细胞 水溶液。使用 SpectraMax ^® 测量吸光度 M5 酶标仪，波长 490 nm（Molecular Devices，美国）。数据采用单向方差分析。 p <0.05 被认为具有统计学意义。

细胞周期分析和细胞凋亡分析

对于细胞周期分析，将BT-474细胞以5 × 10 ⁵ 的密度接种到六孔板中 每孔细胞并允许粘附 16 小时。细胞用单独的 ChrGO/阿霉素复合物或与曲妥珠单抗组合处理 24 小时。收获 BT-474 细胞并在 4°C 下用 70% (v/v) 乙醇固定 24 小时。固定的 BT-474 细胞在 25°C 下用含有核糖核酸酶 A (10 μg/mL) 的碘化丙啶溶液 (15 μg/mL) 染色一小时。然后，用流式细胞仪（BD Biosciences，USA）分析细胞。细胞凋亡实验中，将BT-474细胞以2 × 10 ⁴ 的密度接种于白壁96孔板中。 每孔细胞并允许粘附 18 小时。细胞用 ChrGO/阿霉素复合物、曲妥珠单抗单独或联合处理处理 24 小时。然后弃去培养基，加入 100 µL Caspase-Glo ^® 将 3/7 试剂添加到每个孔中并在室温下孵育 2 小时。通过 SpectraMax ^® 测量发光 M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）。结果通过单向方差分析进行分析。 p <0.05 被认为具有统计学意义。所有研究均按照相关指南和规定进行。

结果与讨论

合成和表征

通过透射电子显微镜 (TEM) 表征合成的 GO 片材的形态。图 1a 显示了 100 nm 以下 GO 纳米片的均匀尺寸分布，平均尺寸约为 45 nm。与壳聚糖相比，GO 的高电子密度表现出更好的对比度，由于其低电子密度和水合性质，壳聚糖几乎不可见 [21]。由于具有更高的表面积，纳米级 GO 或还原的 GO 片已被广泛用作药物载体 [22]。图 1c 中的选区电子衍射 (SAED) 图案显示同心环，这表明存在与氧化石墨烯相对应的多晶性质 [23]。

一 GO纳米片的低倍TEM图像，b 纳米片和 c 的高分辨率 TEM 图像 GO纳米片的典型SAED图案

为了在生理溶液中稳定 GO 纳米片，使用微波系统通过微波辅助还原制备壳聚糖功能化的 GO 纳米片 [24]。所得还原的 GO-壳聚糖（ChrGO）通过紫外-可见光谱法进行分析。图 2a 显示了 GO 和 ChrGO 的 UV-Vis 光谱。 GO 在 230 nm 处表现出尖锐的吸收峰，在 300 nm 处出现肩峰，这归因于 π –π * 芳香族 C=C 键和 n 的转变 –π * C=O 键的转换，分别 [25, 26]。壳聚糖接枝到 GO 后，ChrGO 230 nm 处的峰红移至 270 nm，300 nm 处的肩峰明显消失，这归因于芳香碳原子之间的电子共轭部分恢复[27]。合成的 ChrGO 的黑色溶液如图 2b 所示，这表明形成了部分还原的氧化石墨烯 (p-rGO)。 GO 纳米片和 ChrGO 都很好地分散在去离子水中。 GO或GO衍生物在水溶液中的胶体稳定性对其生物医学应用非常重要。结果表明，还原后壳聚糖与GO结合。

一 GO纳米片和ChrGO在水溶液中的紫外-可见光谱，b GO纳米片与合成ChrGO的照片

进行 FTIR 光谱以表征 GO、壳聚糖和 ChrGO 的结构（图 3a）。 GO 的特征峰位于 3440 cm ^-1 和 1376 厘米 ⁻¹ ，分别对应于 O-H 和 C-OH 键。 1072 cm ⁻¹ 处的峰值 被分配到 C-N-C 的伸缩振动。值得注意的是，壳聚糖分子在 2912 cm ^-1 处的峰 和 2848 厘米 ⁻¹ 归因于 CH3– 和 –CH2– 的伸缩振动 [28, 29]。带有壳聚糖的功能化 p-rGO 产生新键，从而导致 ChrGO 光谱中出现新峰。在 1636 cm ^-1 处 C=O 带的强度显着降低 ChrGO 中的与 GO 中的相比，这表明还原过程去除了 GO 的含氧基团 [30]。 ChrGO 的 FTIR 光谱证实了壳聚糖在 GO 上的成功结合。此外，拉曼光谱用于表征石墨烯的电子性质和结构。 G 波段归因于 E sp 的 2g 声子 ² 碳域，而 D 带分配给 sp 的振动 ³ 碳原子域和无序碳原子。 D 带的强度表示碳片中的紊乱和缺陷的特征[31]。 GO 纳米片的减少也在 D 与 G 带的信号比中进行了分析 [32]。 GO 的代表性拉曼光谱显示 D 波段的两个特征峰 (1341 cm ⁻¹ ) 和 G 波段 (1591 cm ⁻¹ ) 在图 3b 中。 ID/IG值相对强度的变化说明了还原过程中GO电子共轭状态的变化[33]。 D 带的移动显示了还原 GO 的成功功能化。 I的价值 D/我 G 从 0.99 (GO) 增加到 1.12 (ChrGO)，这归因于 sp3 的引入 功能化后的缺陷和石墨烯特征结构的不完全恢复[34]。这一观察结果与之前的报道非常吻合，表明壳聚糖功能化石墨烯的形成[16]。

一 GO、ChrGO 和壳聚糖的 FTIR 光谱，b GO和ChrGO的拉曼光谱

ChrGO 的表面组成由 XPS 确认。 ChrGO 的 XPS 光谱的全扫描显示在 284、399 和 533 eV 处的三个峰，分别分配给 C1s、N1s 和 O1s（图 4a）。相对元素分析显示，与 GO 相比，ChrGO 氧和氮含量增加，碳含量相应降低。图 4b 中显示的 ChrGO 的高分辨率 C1s 光谱表现出四个分离的峰，对应于 C-C 或 C=C (sp ² , 284.7 eV), C-O (环氧/羟基, 286.4 eV), C=O (sp ³ , 288.2 eV) 和 O=C-O（羧酸盐，289.1 eV）键。 ChrGO 中酰胺峰的出现为壳聚糖在 GO 上的功能化提供了证据 [35]。表面丰富的亲水性官能团使 ChrGO 在水溶液中高度溶解，这与 FTIR 结果一致。酵母提取物中的还原性氨基酸和α-亚麻酸等生物分子可能在微波辅助制备ChrGO中发挥重要作用[20]。

一 调查 GO 和 ChrGO 的 XPS 光谱，b C1s的高分辨率光谱

GO 和 ChrGO 的 X 射线衍射（XRD）图如图 5a 所示。在 GO XRD 谱中，11.0°处的主峰和 20.7°处的弱峰清楚地呈现出石墨结构。 11.0°处的特征衍射峰对应于GO的（001）面，表明GO合成成功[36]。 20° 和 24° 之间的小凸起显示了石墨部分，这归因于未氧化的原始石墨 [37]。随着壳聚糖的功能化，GO的（001）峰消失，而21.4°的宽衍射峰变得突出。这种转变可归因于 GO 的减少，其中减少使 rGO 包比 GO 更紧密。 ChrGO 样品的 (002) 反射非常广泛，表明样品沿堆叠方向的有序性非常差，这可能归因于 GO 的不完全还原[33]。已经通过热重分析 (TGA) [38] 研究了 GO、壳聚糖和 ChrGO 的分解行为。 ChrGO、GO 和壳聚糖的 TGA 曲线如图 5b 所示，它们是在氮气气氛中测量的。 GO 在 100°C 以下开始减轻重量，这归因于堆叠结构中吸附的游离水的消除 [39]。 GO 在 191-231°C 范围内失去了 42% 的重量，这与不稳定的含氧基团的分解有关。 ChrGO 在 100-250°C 下的重量损失率明显低于 GO，很明显，与 GO 相比，ChrGO 显示出不同的分解模式。 ChrGO 和纯壳聚糖的热消除发生在 250 至 440°C，这与更稳定的官能团（例如壳聚糖的糖苷单元和羧基）的解聚和热解有关 [40]。与 GO 相比，ChrGO 是热稳定的，在 250-440°C 的第一分解阶段重量损失主要为 36%，而 GO 几乎没有重量损失。在 450-800°C 的高温范围内，显着的重量损失是由于碳骨架的热降解，这可能归因于来自酵母提取物的壳聚糖残留物和氨基酸等生物分子 [41]。 <图片>

一 GO和ChrGO的XRD图谱，b GO、壳聚糖和ChrGO的TGA曲线

GO和ChrGO的表面电荷由Malvern Zeta Nano ZS-90仪器测量，是胶体稳定性的重要参数。 GO 纳米片上较高的表面电荷密度产生了更稳定的胶体分散体 [42]。如附加文件 1：图 S1 所示，GO 的 zeta 电位从 pH 3 时的 − 10.7 mV 单调下降到 pH 11 时的 − 35.5 mV，这证实了 GO 纳米片表面的负电荷。 ChrGO 的 zeta 电位值相对低于 GO 在 3 到 11 范围内的任何 pH 值的电位。 ChrGO 纳米片在整个 pH 值范围内表现出稳定性，而据报道还原的 GO 胶体在去离子水中稳定性较差，因为增加 π –π 堆积在脱氧表面[43]。尽管壳聚糖表面存在一些游离胺基 [44]，但没有实现更高的 ChrGO zeta 电位。 ChrGO 较低的 zeta 电位值可归因于酵母提取物中丰富的负氨基酸分子，这增强了生理溶液中的胶体稳定性 [20]。 ChrGO 带负电荷的表面使其有可能用于药物的装载和递送。

合成 ChrGO 的生物相容性

合成的 ChrGO 的生物相容性对其在药物递送中的应用很重要。通过细胞毒性试验研究了 ChrGO 和 GO 的细胞毒性。 Cos-7 细胞和 BT-474 细胞在 ChrGO 或 GO 存在下孵育 24 小时。细胞毒性结果如图6所示。可以得出结论，ChrGO对Cos-7和BT-474细胞没有明显的细胞毒性。即使在 100 μg/mL 的浓度下，细胞活力也超过 90%。然而，GO 以剂量依赖性方式表现出显着的细胞毒性，Cos-7 和 BT-474 细胞在 100 μg/mL 的浓度下分别只有 73.0 ± 0.5% 和 71.0 ± 0.5% 的细胞存活率。结果表明，在GO表面功能化的壳聚糖显示出极大的低细胞毒性和改善的生物相容性。据报道，用大分子对 GO 进行表面功能化可显着减弱其细胞毒性作用 [45]。胡等人。报道细胞培养基中的胎牛血清显着降低GO对非小细胞肺癌A549细胞的细胞毒性[46]。

GO 和 ChrGO 的生物相容性。用a培养不同浓度的纳米颗粒 Cos-7 细胞和 b BT-474细胞，测定其对细胞活力的影响

药物的加载和释放

ChrGO 作为药物载体的潜在生物医学应用是通过药物加载和释放行为来衡量的。由于其非常大的比表面积，石墨烯衍生物的结构特征对于芳香族药物递送非常有效。阿霉素是治疗多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤的原发肿瘤化疗药物之一，常被用作评估石墨烯衍生物给药系统的模型药物[47]。阿霉素在 ChrGO 纳米片上的负载能力通过阿霉素在 490 nm 处的特征 UV-Vis 吸收峰来验证。正如预期的那样，结合在 ChrGO 纳米片上的阿霉素的最大负载效率高达 169.8%，这部分归因于 ChrGO 纳米片的大表面积。载有阿霉素的ChrGO/阿霉素纳米复合材料很容易分散到生理缓冲液中，呈现略带红色的透明溶液。

为了探索阿霉素从 ChrGO/阿霉素复合物中的释放曲线，引入了 PBS 的不同 pH 值来模拟肿瘤细胞环境。附加文件 1：图 S2 显示了阿霉素从 ChrGO/阿霉素在 pH 5 和 7.4 中的累积释放曲线。从 ChrGO/阿霉素释放的阿霉素的特征是在 pH 5.0 PBS 溶液中的初始快速释放和缓慢释放阶段。阿霉素的累积释放在前 3 小时为 6.5%，然后在 pH 5.0 的 96 小时内缓慢增加至 26.7%。相比之下，ChrGO/阿霉素的阿霉素百分比增加较慢并且在 pH 7.4 时较低，显示阿霉素的释放百分比从前 3 小时的 2.5% 到 96 小时的 7.4%。先前的研究表明，在 pH 7.4 的介质中，功能化 GO 的药物释放曲线非常缓慢 [48]。 ChrGO 上羧基的质子化降低了阿霉素和 ChrGO 之间的 π-π 堆积、氢键和静电相互作用，促进了阿霉素在醋酸介质中的释放 [49]。 pH 敏感性赋予 ChrGO/阿霉素进行位点特异性药物递送的潜力，从而增加肿瘤细胞的细胞毒性。

ChrGO/阿霉素复合物的治疗功效

通过增殖抑制试验研究了 ChrGO/阿霉素复合物在 HER2 过表达 BT-474 癌细胞中的治疗功效。 HER2 受体的过度表达在 BT-474 乳腺癌细胞的转化中具有关键作用。单独使用曲妥珠单抗（一种抗 HER2 单克隆抗体）治疗会显着抑制 BT-474 细胞的生长 [50]。 As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

一 In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p  < 0.01, ***p  < 0.001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

一 Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p  < 0.01, ***p  < 0.001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.

结论

In the present work, the chitosan-functionalized graphene oxide nanosheets were structured with microwave-assisted reduction, which demonstrated biocompatibility and good dispersion stability. The as-prepared nanocomposites showed high efficiency of drug encapsulation and delivery. The ChrGO/adriamycin nanosheets displayed significant growth inhibition of BT-474 in a dose-dependent manner. The combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in superior therapeutic efficacy in BT-474 cells compared to that with each agent alone. The results are favourable for the development of intracellular nanocarriers to deliver drugs in a controlled manner, which is expected to improve the therapeutic effect on HER2-overexpressing cancer therapies.

数据和材料的可用性

The datasets supporting the conclusions of this current study are available from the corresponding authors upon reasonable request.

缩写

ChrGO:

Chitosan-functionalized graphene oxide

EGFR:

Epidermal growth factor receptor

HER2:

Human epidermal growth factor receptor-2

开始：

氧化石墨烯

DMEM：

Dulbecco's modified Eagle medium

FBS：

胎牛血清

TEM：

透射电子显微镜

UV–Vis:

紫外可见

FTIR：

傅里叶变换红外

XRD：

X射线衍射

XPS：

X射线光电子能谱

TGA：

热重分析

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

SAED：

Selected-area electron diffraction

TGA：

Gravimetric analysis