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原位电纺姜黄素复合纳米纤维对耐药菌的双重抗菌作用

摘要

尤其是由多重耐药菌引起的细菌感染,仍然威胁着人类的生命。光动力疗法(PDT)可以有效杀灭细菌,基于纳米纤维的PDT可以有效减少对正常组织的损伤。然而,目前涂在纤维表面的光敏剂会释放到伤口,引起一些副作用。并且传统方法制备的纳米纤维在伤口上的粘附性较差,由于其短程效应而严重降低了PDT效果。在这里,核壳姜黄素复合纳米纤维是通过自制的便携式静电纺丝装置通过原位静电纺丝方法制备的。与传统制备方法相比,所获得的复合纳米纤维在不同生物表面表现出优异的粘附性。在 808 nm 照射下,这些复合纳米纤维有效地产生单线态氧 ( 1 O2) 没有姜黄素脱落。这些复合纳米纤维暴露于耐药菌后,表现出双重抗菌行为,有效杀灭耐药菌。这些具有优异粘附性的双重抗菌纳米纤维膜可能有利于伤口感染作为抗菌敷料的应用。

背景

细菌感染不及时治疗会引起败血症,败血症严重危害生命健康[1,2,3]。虽然抗生素可以杀死细菌,但长期使用抗生素会导致产生耐药菌,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)[4,5,6]。 MRSA作为一种多重耐药菌,是引起伤口感染的常见细菌之一[7]。在这种情况下,有必要找到安全杀死细菌而不产生耐药性的策略。已经证明光动力疗法(PDT)是一种有效的杀菌方法[8,9,10,11]。然而,大多数用于 PDT 的光敏剂需要紫外光或短波长激发 [12, 13]。由于光在生物体内的穿透深度取决于波长,因此紫外光和可见光的穿透深度较浅,而近红外(NIR)光的穿透深度相对较深。更糟糕的是,紫外线和短波光会严重灼伤人体组织。为了在深层组织中实现安全、抗菌的治疗,开发近红外光激发的光敏剂是一种需求和趋势。上转换纳米粒子 (UCNP) 可以将 NIR 光转换为短波长光 [14, 15]。由于这种特性,光敏剂可以设计为与上转换结合以实现 NIR 激发。 UCNPs 用作波长转换站,将 NIR 光转换为短波长以激发光敏剂并产生单线态氧 ( 1 O2) [16,17,18,19]。然而,以前的研究大多是在制备光敏剂包覆的纳米颗粒结构上。裸露在纳米粒子最外层的光敏剂容易脱落[20, 21],而且由于直接接触对生物组织也有一定的副作用,如抑制组织胶原生长[22, 23]。事实上,光敏剂之所以能达到杀菌,是由于其产生单线态氧,也就是说光敏剂不需要直接接触细菌或生物组织。因此,我们可以设计一个间隔物将光敏剂与生物组织分开,从而避免可能的副作用。

静电纺丝是一种快速有效的制备纳米纤维的方法,包括有机和无机纳米纤维 [24,25,26,27,28]。在纳米纤维的制备过程中,纳米粒子很容易与纤维结合形成复合纳米纤维。形成复合纳米纤维的方法主要有两种。一种是在纳米纤维内部掺杂粒子 [29],另一种是将粒子加载到纳米纤维的表面上 [30, 31]。考虑到将光敏剂与生物组织分离的目的,将光敏剂掺入纳米纤维中比负载在纤维表面的光敏剂更可取,后者容易脱落。然而,如果纳米纤维是疏水的,不能渗透,单线态氧很难产生并传递到纤维表面,从而实现抗菌性能 [32]。但亲水性纳米纤维在被组织液污染时很容易溶解。因此,有必要将近红外光敏剂与纳米纤维结合,确保光动力纳米纤维能够有效杀灭细菌,尤其是耐药菌。

在这项研究中,姜黄素被用作光敏剂,因为它来自生物提取物的广泛来源。 UCNPs的核壳纳米结构作为波长传输站,显示出高转换效率,产生 1 氧气。 UCNPs@姜黄素复合纳米纤维是通过自制静电纺丝装置通过原位静电纺丝法制备的。该方法获得的复合纳米纤维在不同生物表面的附着力优于传统的静电纺丝制备方法。在 808 nm 照射下,这些复合纳米纤维可以有效地产生 1 没有姜黄素脱落的 O2。这些复合纳米纤维被MRSA耐药菌污染后,会发生双重抗菌行为,有效杀灭耐药菌。

方法

材料

氯化铥、氯化镱、氯化钕和氯化钇购自 Sigma-Aldrich。甲醇、乙醇、环己烷、姜黄素、二氯甲烷、丙酮、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、聚己内酯 (PCL) 和聚乙烯亚胺 (PEI) 购自国药集团化学试剂。所有材料均未经进一步纯化直接使用。

核壳合成 NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Nd@Curcumin

NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Nd 的上转换纳米粒子 (UCNPs) 是使用共沉淀法合成的 [33, 34]。然后,加入 200 mg 制备的 UCNP、90 mg PEI 和 180 mg 姜黄素并溶解在二氯甲烷中。反应物在室温下均匀搅拌20h,所得产物离心纯化,乙醇洗涤2次。

通过原位静电纺丝制备姜黄素复合纳米纤维

将 1 克 PCL、0.16 克 PVP 和 0.1 克 NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Nd@Curcumin 添加到 5 mL 丙酮中。搅拌 12 小时后,获得用于静电纺丝的均质前体溶液。在 5 mL 注射器中取 3 mL 前驱体溶液,使用自制的手持式静电纺丝设备进行静电纺丝,该设备由直径为 0.4 mm 的金属针、两节碱性电池和可转换的高压转换器组成。 3 V 电池至 10 kV 用于静电纺丝。收集器与静电纺针之间的静电纺丝距离约为10 cm。

检测 1 O 2 编队

单线态氧传感器绿色 (SOSG) 用于检测 1 O2 的形成。在石英比色皿中加入 9 × 9 平方毫米的具有不同浓度 UCNPs@Curcumin 的纳米复合纤维膜,然后加入 3 mL 含有 25 μM SOSG 的甲醇。之后,比色皿在 808 nm 激光下照射不同的照射时间。用504 nm激发波长的荧光分光光度计测量该溶液的荧光强度,反映单线态氧水平。

抗菌检测

MRSA和大肠杆菌的耐药菌被用来评价抗菌能力。简而言之,在胰蛋白酶大豆肉汤培养基中培养细菌菌株。含有细菌菌株的培养基在 37°C 下孵育 15 小时。培养后菌株浓度为1 × 10 6 CFU/毫升。总共将 100 μL 细菌溶液放入无菌超净台上的 96 孔板的每个孔中。然后,将一块直径为 6 mm 的圆形纤维膜加入到 96 孔板的每个孔中。 808 nm 激光照射 20 分钟后,将板中的细菌溶液用无菌水稀释 10 倍。将 10 μL 稀释剂置于营养琼脂平板中以获得均匀包被的琼脂平板。处理过的琼脂平板在恒温细菌培养箱中于 37°C 培养 18 小时,然后拍照。对照组除不使用808nm激光照射外,其余步骤同上。每组重复5个板。

特征化

TEM 和 SEM 图像取自 JEM-2010 和 SU-1510 电子显微镜。荧光光谱在爱丁堡 FLS1000 荧光分光光度计上测量。吸收光谱在 Shimadzu UV2550 光谱仪上记录。傅里叶变换红外光谱在 Nicolet iS50 光谱仪上进行。 zeta 电位用 WJL-608 分析仪测量。用PT-602Atest设备用固滴法测试亲水性。

结果与讨论

纳米粒子和复合纳米纤维的表征

图 1a 显示了 NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Nd 纳米粒子 (UCNP) 的 TEM 图像。它展示了平均直径约为 45 nm 的 UCNP 的均匀尺寸分布。进一步测试这些纳米粒子的 zeta 电位为 + 19 mV(添加文件 1:图 S1)。 UCNPs 被姜黄素包覆后,图 1b 显示了核壳结构,姜黄素壳厚度约为 5 nm。然后,将这些核壳姜黄素纳米颗粒嵌入到 PCL/PVP 纤维中。图 1c 显示了这些由自行设计的手持静电纺丝设备制备的复合纳米纤维的 SEM 图像。该装置制备的连续非断裂纳米纤维的直径约为 400 nm,纤维均匀性与传统静电纺丝装置相似(附加文件 1:图 S2)。需要注意的是,这款便携式静电纺丝设备可以使用两节 1.5 V 的干电池进行操作(附加文件 1:图 S3),摆脱了使用市电的限制。结合其重量轻(重量为 160 克)和小尺寸的其他优势,它将有利于户外使用。图 1d 显示了这些复合纳米纤维的 TEM 图像,表明纳米颗粒在纳米纤维中具有良好的分散性。

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a 的 TEM 图像 NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Nd 纳米粒子 (UCNPs) 和 b 核壳结构的UCNPs@姜黄素纳米颗粒。 c 姜黄素复合纳米纤维的SEM图像,d 姜黄素复合纳米纤维的TEM图像

在 NaYF4:Yb/Tm 核上涂覆 NaYF4:Nd 壳的原因是它可以增强光致发光(图 2a)。由于 UCNPs 的荧光光谱与姜黄素的 UV-Vis 吸收光谱重叠很好(图 2b),这意味着 UCNPs 更强的光致发光可以将更多的能量转移到姜黄素上,这有利于光敏剂的激发。此外,考虑到波长为 808 nm 的 NIR 光比波长为 980 nm 的 NIR 光更深入地穿透活体组织,这种 NaYF4:Nd 壳的引入可以将激发波长从 980 调制到 808 nm(附加文件 1 :图 S4),从而减少对正常组织的不良灼伤。进一步测量了 FTIR 测量值。从图 2c 中可以看出,C=O 在 1628 cm -1 处的伸缩振动 , C–O 在 1282 cm −1 , 和 C–O–C 在 1028 cm −1 发生在源自姜黄素(绿线)的纳米复合颗粒(橙线)中。同时,在 1125 cm −1 处存在 C–N 的伸缩振动 ,来自 PEI(蓝线)。它们的分子结构图在附录中说明(附加文件 1:图 S5)。此外,在大约 1660 cm −1 处存在弱 C=C , 对应于 UCNPs 合成同时的油酸。可以展示UCNPs@姜黄素复合纳米纤维的成分。

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核壳 NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Nd 在 808 nm 处激发的荧光光谱,b UCNPs的荧光光谱和姜黄素的紫外-可见吸收光谱,c UCNPs@Curcumin、姜黄素和PEI的FTIR光谱,d UCNPs和UCNPs@Curcumin的时间分辨荧光光谱

图 2d 展示了 UCNPs 在涂覆姜黄素前后的荧光衰减曲线。结果表明,用姜黄素壳包覆后,UCNPs 的荧光寿命从 700 μs 降低到 390 μs。基于γ =1 - τ 2/τ 1,其中τ 2 和 τ 1是姜黄素包裹前后UCNPs的寿命,γ 是能量转移效率 [35]。因此,γ 计算为 44.3%。获得如此高的能量转移效率,首先是由于姜黄素的吸收光谱和 UCNPs 的光致发光光谱之间的良好重叠(图 2b),因此它们之间可以发生非辐射能量转移。第二个方面是 UCNPs 有一个 NaYF4:Nd 壳,它增强了荧光强度,从而增加了它们的光谱重叠积分面积。第三个方面是姜黄素和UCNPs之间的距离是涂层厚度(<5 nm),这个小距离有利于高效荧光共振能量转移(FRET)的产生。 FRET方法可以获得高达44.3%的能量转移效率,这也有利于 1 的后续高效生产 氧气。

生产 1 来自复合纳米纤维的 O2

为评价纳米复合纤维生产 1 的能力 O2,使用 SOSG 方法。首先,我们采用固定掺杂浓度的纳米复合纤维,观察 1 的产生 不同辐照时间下的O2。如图 3a 所示,对于固定浓度,例如 0.20 wt%,照射时间是影响 1 生成的因素之一 氧气。照射时间越长, 1 产生了 O2。然而,这也表明,虽然 1 的浓度 随着辐照时间的增加,O2 逐渐增加,上升速率逐渐减慢,20 分钟后几乎保持不变,表现为密集的曲线区间。这种现象可能是由于产生 1 导致局部耗氧快 O2 持续近红外光辐射,导致局部氧含量相对较低,从而降低了 1 的上升率 氧气。

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在不同a下暴露于808 nm光下的UCNPs@Curcumin复合纳米纤维膜的单线态氧产生 浓度和b 照射时间

观察掺杂浓度对生成 1 的影响 O2,进一步描绘了图 3b。如图 3b 所示,对于固定的照射时间,例如 20 分钟,随着掺杂浓度的增加, 1 产生了 O2。但是, 1 的上升速度 当浓度大于 0.20 wt% 时,O2 减慢。这些实验结果表明不需要无限增加照射时间和掺杂浓度来产生更多的 1 氧气。最佳选择是 0.20 wt% 和 20 min,因此在接下来的实验中将采用该浓度和照射时间。

原位电纺纳米纤维膜的润湿性和粘附性

考虑生产 1 O2是需要纤维中的UCNPs@Curcumin纳米颗粒与体液中的氧气相互作用的过程,因此进一步测试了这种纤维膜的接触角。图 4a 显示了一滴水滴在这种复合纳米纤维膜的表面上,以及 20 秒后的润湿性。与纯 PCL 纳米纤维膜相比(图 4b),复合纳米纤维膜具有更好的润湿性。有趣的是,将复合纳米纤维膜浸泡在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中后,吸收光谱仪在 PBS 中没有检测到 UCNPs@姜黄素,这意味着没有姜黄素从纤维中脱落。原因可能是姜黄素包覆在 UCNPs 上,因此 UCNPs@Curcumin (~ 50 nm) 的尺寸太大而无法穿透纤维。与将光敏剂包覆在颗粒或纤维上的方法相比,先增大姜黄素尺寸再掺入润湿纤维中,可有效避免光敏剂脱落,增强 1 的产生和扩散。 氧气。此外,考虑到PDT的短程效应和传统静电纺丝方法制备的纤维膜对伤口表面的附着力差(图4c;附加文件1:图S6),光动力效应会受到影响由于纤维膜与表面之间的间隔。幸运的是,这些姜黄素复合纳米纤维可以通过原位静电纺丝法制备,具有良好的形态(图 1c),并且在不同物体表面也表现出良好的粘附性(图 4d)。这意味着原位静电纺丝沉积法制备光动力纤维膜比传统的将纤维膜收集在箔上然后压在缠绕表面的纺丝方法更可取。

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a基体复合纳米纤维膜的水接触角测量 PCL/PVP 和 b PCL,c 传统电纺纳米纤维膜和原位沉积电纺纳米纤维膜,d 不同物体表面的原位沉积电纺

姜黄素复合纳米纤维的双重抗菌作用

由该装置制备的纳米复合纤维已通过 MTT 测定证明是无毒的(添加文件 1:图 S7)。此外,为了证明该纤维具有良好的抗菌性能,采用计数法对复合纳米纤维的抗菌性能进行评价。如图 5 所示,无论 808 nm 光是否照射在纯纤维上,​​都没有抗菌性能(图 5a、b)。这些结果表明,808nm 光本身没有杀菌作用。当纤维掺杂 UCNPs 时,细菌不会减少,这证实了 UCNPs 没有杀菌作用(图 5a',b')。有趣的是,当纤维中掺入姜黄素后,细菌数量在一定程度上减少,证明姜黄素本身显示出一定的抗菌活性(图5c,c')。此外,在近红外光照射下,掺有 UCNPs@Curcumin 的纤维产生了明显的杀菌效果(图 5d',e')。结合图 3 的结果,这些杀菌结果表明 1 UCNPs@Curcumin 在 808 nm 照射下产生的 O2 可以有效杀死细菌。另一方面,由于姜黄素的吸光度在可见光范围内(图 2b),因此在 808 nm 照射和不照射下姜黄素的抗菌活性相同,因此 808 nm 光没有效果。这也是姜黄素被设计用于包裹 UCNPs 表面的原因。此外,图 5d、e 显示了分别掺杂 0.15 重量%和 0.20 重量%的 UCNPs@Curcumin 的纤维。通过对比发现,0.20wt%组在光照20min时表现出更好的杀菌性能,抗菌效果达到95%。这是因为 1 光敏剂姜黄素在光动力作用下产生的O2可以杀死耐药菌。这个结果也与 1 一致 O2结果见图3。这些数据进一步表明,掺入UCNPs@Curcumin的纤维由于其双重抗菌活性可以杀死MRSA,即掺入UCNPs@Curcumin和PDT的纤维,且PDT比掺入UCNPs@的纤维具有更好的抗菌作用姜黄素。此外,我们还对大肠杆菌进行了实验,这也证实了原位电纺姜黄素复合纳米纤维对耐药菌具有双重抗菌作用(补充文件1:图S8)。并且通过 MRSA 的 H&E 染色进一步验证了纳米纤维的抗炎作用(添加文件 1:图 S9)。伤口感染不同处理后,无纳米复合纤维组收集到大量中性粒细胞,因组织损伤和化脓性感染呈紫蓝色细胞团。然而,纳米纤维组中出现了少量肉芽组织和红细胞,这间接反映了纳米复合纤维的抗菌性能。对伤口感染的炎症有阻断作用。

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不同样品掺杂纳米纤维对MRSAa的抗菌性能 –e 没有和 a′e′ 808 纳米曝光:a , a′ 对照组,b , b′ UCNPs 组,c , c′ 姜黄素组,d , d′ UCNPs@姜黄素与低剂量组和e , e′ 高剂量组

结论

总之,核壳姜黄素复合纳米纤维是通过自制的便携式静电纺丝装置通过原位静电纺丝方法制备的。所获得的复合纳米纤维在不同生物表面上表现出比传统制备方法优越的粘附性。该方法先增大姜黄素的粒径,然后将其掺杂到可湿性纤维中,可有效避免光敏剂的脱落,从而提高 1 的产量。 O2 及其扩散,这可能为设计其他光动力纳米材料提供灵感。这些复合纳米纤维被耐药菌污染后,表现出双重抗菌行为,有效杀灭耐药菌。这种双重抗菌纳米纤维膜具有优异的粘附性,可与止血结合用作抗菌敷料,从而实现户外止血。

数据和材料的可用性

在当前研究期间生成和/或分析的数据集可根据合理要求从相应的作者处获得。

缩写

PDT:

光动力疗法

1 氧气:

单线态氧

MRSA:

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

近红外:

近红外

UCNP:

上转换纳米粒子

PVP:

聚乙烯吡咯烷酮

PCL:

聚己内酯

PEI:

聚乙烯亚胺

SOSG:

单线态氧传感器绿色

烦恼:

荧光共振能量转移

PBS:

磷酸盐缓冲液


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