水分散PEG-聚合物复合物负载4-噻唑烷酮化疗药增强大鼠胶质瘤C6细胞凋亡活性

摘要

目的

研究4-噻唑烷酮衍生物与含PEG聚合物纳米载体复合物的水制剂是否增强其对大鼠胶质瘤C6细胞促凋亡作用。

方法

体外用大鼠胶质瘤C6细胞研究4-噻唑烷酮衍生物抗肿瘤机制。评估细胞存活、细胞周期分布、Annexin V表达，彗星实验估计DNA损伤。利用新型水基制剂的4-噻唑烷酮衍生物与聚合物纳米载体复合物增强对C6细胞促凋亡作用。

结果

所研究4-噻唑烷酮衍生物通过凋亡机制杀灭大鼠胶质瘤C6细胞，经FACS分析预G1期细胞、Annexin V阳性C6细胞出现、高等级DNA彗星数量增加证实。与含PEG聚合物纳米载体复合显著增强对大鼠胶质瘤C6细胞促凋亡效应，上述所有方法均证实。

结论

4-噻唑烷酮衍生物与含PEG聚合物纳米载体复合赋予其水溶性并增强对大鼠胶质瘤C6细胞促凋亡效应。

引言

化疗是许多肿瘤主要治疗模式，抗癌药物常作为最后选择，尤其癌症已扩散时 [1]。然而严重副作用降低许多现用抗癌药临床疗效。因此持续迫切需要开发副作用减少或最小化的替代或协同抗癌药物 [2]。

抗癌药物低水溶性是阻碍其开发和临床应用普遍严重问题，许多高活性有前景化疗药因低水溶性被排除 [3]。高浓度表面活性剂和助溶剂用于溶解不溶性抗癌药；但这些物质也产生不良副作用，限制许多抗癌药使用 [4]。

药物开发巨大挑战是消除或至少减少高活性药物负面副作用，特别是表现全身毒性显著限制使用的抗肿瘤药 [5-9]。有效解决途径是使用药物多功能纳米载体，使有毒抗肿瘤药在特定器官组织靶向细胞递送位点结合 [8, 10, 11]。纳米粒子小尺寸、可控特定结构、大表面积、形状赋予其相较其他材料诸多优势 [5, 8, 9]。使用纳米粒子可优化疗效、最小化副作用、改善癌症治疗 [12, 13]。因此早因高全身毒性失败药物现因包含生物利用度改善、可控释放递送系统获得临床再用机会。此类药物-载体复合物更易穿越血脑屏障等天然屏障或单个细胞膜。纳米粒子大表面积使其能与特定载体生物分子形成复合物，协助药物递送至靶器官，显著减少甚至完全消除负面副作用，允许单次给药最小有效剂量增加，增强药物作用效力，为个性化药理治疗提供新刺激。此外纳米粒子可包裹改善特定药物溶解度、稳定性、吸收分子 [11, 13-15]。药物递送系统提供药物血液中延长循环、病理生理过程期间药物累积能力、有效转移活性物质分子入细胞及细胞器。纳米粒子须稳定、一定时期维持化学结构、同时具备生物降解性 [16, 17]。

评价新抗癌药，重要的是用各种靶向人癌细胞系和体内实验肿瘤模型测量其细胞毒活性和效力。化疗常因凋亡过程缺陷失败，凋亡在致瘤变化后药物诱导细胞死亡中起关键作用 [18-21]。

因许多恶性细胞可逃避凋亡死亡，设计开发新抗癌药应采用理性方法。创新抗癌药主要目标：（1）寻找克服影响药物独立作用机制个别癌细胞突变途径；（2）设计能同时靶向独立通路化疗方案。更好理解癌症遗传学与治疗敏感性关系是开发新型高效抗癌药关键 [22]。

早期研究我们证实合成4-噻唑烷酮衍生物（Les-3288、Les-3833、Les-3882）可能用不同于其他抗癌药机制杀灭大鼠C6胶质瘤和人U251胶质母细胞瘤细胞，区别于阿霉素（Dox）。Les-3288未显著影响处理细胞活性氧（ROS）水平 [23, 24]。应强调这些强效抗肿瘤药在实验动物体内表现全身毒性较低，通过肿瘤细胞和动物毒性生化参数测得，相较Dox [7, 8]。因此抗肿瘤药与聚合物纳米载体（PNC）结合、以稳定水递送系统形式应用，可降低其游离形式在动物器官毒性效应 [7, 8]。

本工作旨在体外和体内研究水基制剂中4-噻唑烷酮衍生物与含PEG PNC复合物诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡，比较游离形式这些衍生物诱导凋亡。

材料与方法

抗癌药物

杂环4-噻唑烷酮衍生物（Les-3288和Les-3833化合物，图1）在Danylo Halytsky利沃夫国立医科大学药物、有机与生物有机化学系合成，如前所述 [25]。

研究化合物结构——Les-3288和Les-3833

细胞培养前，这些化合物溶于二甲亚砜（DMSO，Arterium，利沃夫，乌克兰）。溶液额外沸水浴5 min，稀释蒸馏水达工作浓度。培养基中DMSO终浓度<0.1%。Dox从乌克兰辉瑞（意大利）代表处当地药房购买。

聚合物纳米载体

药物递送PNC在利沃夫理工国立大学有机化学系合成，用早前描述方法 [26, 27]。Poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG合成经后续阶段：自由基共聚合5-tert丁基过氧基-5-甲基-1-己烯-3-炔（VEP，0.41 g，0.5 mol）（过氧化物单体按描述方法合成 [28]）和环氧基甲基丙烯酸酯（GMA，7.72 g，12.2 mol）（Sigma-Aldrich，美国）于乙酸乙酯（7.9 mL）（Merck，德国达姆施塔特）中，用偶氮二异丁腈（AIBN，0.129 g，0.05 mol）（Merck，德国达姆施塔特）作自由基引发剂。聚合343K进行至最大转化率65%。Poly(VEP-co-GMA)作主链通过侧链环氧基与聚乙二醇甲基醚（mPEG）加成反应接侧PEG链。硼三氟醚合物（0.027 mL，0.031 mol）（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）加入共聚物（1.0 g）二恶烷（20 mL；Merck，德国达姆施塔特）溶液中313 K搅拌3 h。mPEG（2.5 mg，3.35 mmol）（Sigma-Aldrich，美国）溶于二恶烷（15 mL）混入主链聚合物溶液313 K搅拌6 h。透析袋（分子量截留6-8 kDa，Sigma-Aldrich，美国）除未反应mPEG。梳状poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG室温真空干燥至恒重。PNC结构和特性见图2，前文描述 [29]。

PNC示意结构——poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG，主链基于不饱和过氧化物2-tert-丁基过氧基-2-甲基-5-己烯-3-炔（VEP，记“k”）共聚物，侧链含环氧基甲基丙烯酸酯（GMA，记“l”）和聚乙二醇（PEG，记“m”）

制备水基PNC溶液：0.09 g PNC溶于0.9 mL DMSO。此PNC溶液加入8.0 mL 0.9% NaCl溶液。搅拌0.5 h，超声10 s。水分散复合物通过按顺序滴加DMSO中4-噻唑烷酮和PNC溶液入水中得：0.045 g PNC溶于0.15 mL DMSO（Sigma-Aldrich，美国），0.0015 g Les-3288（或Les-3833）溶于0.10 mL DMSO。PNC和4-噻唑烷酮溶液混合加入4.25 mL 1%水溶NaCl溶液超声10 s。

此表面活性PNC含接枝疏水主链亲水PEG链（图2a）。水溶液中两性PNC形成胶束样结构可溶解不溶性化合物（如药物）或吸附药物于纳米粒子表面，提高生物相容性。开发高稳定水分散4-噻唑烷酮化疗药技术包含：稀释DMSO溶液转入含聚合物表面活性剂PNC沉淀盐水溶液时纳米级药物颗粒成核，为纳米粒子表面提供聚合物包覆。结果因聚合和沉淀，复合物稳定防止分散。此外，4-噻唑烷酮衍生物纳米复合物受保护免受周围生物微环境可能相互作用。此保护使其体内停留更久不失稳定性、在靶组织器官累积不引起负面副作用。因此此修饰提供抗癌化合物纳米粒子水分散体增强聚合和沉淀稳定性。

PNC胶束和PNC与杂环4-噻唑烷酮复合物纳米粒子尺寸经动态光散射（DLS）用Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments GmbH，德国斯图加特）和DynaPro NanoStar（Wyatt Technology，美国圣巴巴拉）及非侵入式后向散射（NIBS）技术25°C测光子相关谱。DLS测量样品按上述制备，必要时生物蒸馏水稀释，pH 6.5-7.0。每样品测3-5次（每次测5循环，测量间隔5 min）。图3显PNC胶束微观结构尺寸分布及PNC与杂环4-噻唑烷酮（Les-3833和Les-3288）复合物纳米粒子DLS分析。PNC胶束及PNC包覆4-噻唑烷酮纳米粒子尺寸形貌经透射电镜JEM-200А（JEOL，日本）200 kV加速电压研究 [30, 31]。样品按上述制备，必要时生物蒸馏水稀释。超声分散仪UZDN-1A（Ukrrospribor Ltd.，乌克兰）喷雾测试溶液于衬底促进均匀包覆。铜网沉积薄非晶碳膜作衬底。DLS和TEM研究得PNC胶束及与杂环4-噻唑烷酮（Les-3288和Les-3833）复合物尺寸形貌见图3。

PNC（左）和PNC+Les-3833复合物（右）透射电镜（TEM）图像

DLS和TEM研究显PNC胶束尺寸50±25 nm，PNC与杂环4-噻唑烷酮Les-3833和Les-3288复合物形成纳米粒子分别140±25 nm和155±30 nm。PNC与4-噻唑烷酮衍生物复合物水分散体高度稳定，吸附PNC壳层保护噻唑烷酮纳米粒子表面免聚合和沉淀。图4显纳米粒子水体系中尺寸变化可忽略，多次水稀释及PNC与4-噻唑烷酮复合物水体系老化6个月后均稳定。

PNC和复合物流体动力学直径DLS研究（a）及PNC-药物复合物平均尺寸随分散稀释依赖性（b）：水分散PNC（1）、Les-3833+PNC复合物（2）、Les-3288+PNC复合物（3），以及Les-3833+PNC（1-3）和Les-3288+PNC（4-6）分散体储存2天（1.4）、4个月（2.5）、6个月（3.6）后流体动力学尺寸（c）

细胞培养

大鼠C6胶质瘤细胞系自乌克兰国家科学院分子生物学与遗传学研究所细胞库获取。细胞培养于Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Sigma，美国）补10%胎牛血清（Sigma，美国）。5% CO₂、95%湿度、37°C CO₂培养箱培养。细胞每2-3天按1:5比例传代。

研究物质细胞毒性评价

细胞接种24孔板，浓度100,000 cells/mL每孔。（Greiner Bio-One North America，Inc.，美国门罗）。适应24 h后加入研究物质，浓度0.1、0.5、1.0 μM。血球计数板用台盼蓝染料（DV-T10282，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific Corp.，美国沃尔瑟姆）0.01%终浓度、加入细胞悬液2 min后定期计数。死细胞因质膜损伤摄取染料。

流式细胞术

研究细胞周期和凋亡，C6细胞用Les-3288、Les-3833及其与PNC复合物、游离PNC处理，磷酸缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤，4°C 1000 rpm离心5 min沉淀，冷PBS（200万细胞/1 mL PBS）重悬。加绝对乙醇（-20°C预冷）4 mL分次固定，轻混。固定样品-20°C保存至使用（不超1周）。荧光激活细胞分选（FACS）分析：样品4°C 1000 rpm离心5 min，弃上清，细胞沉淀1 mL PBS重悬。加100 μL无DNase RNase（Sigma，美国）孵育37°C 30 min。各样品加100 μL碘化丙啶（PI）（Sigma，美国，1 mg/mL）室温孵育10 min。最后转入Falcon管，FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，美国山景城）和Summit v3.1软件（Cytomation，Inc.，美国科林斯堡）监测细胞周期和凋亡参数。

Annexin V阳性（凋亡）细胞测量用FACS分析。大鼠C6胶质瘤细胞按图示浓度用0.1、0.5、1.0 mg/mL PNC、Les-3288、Les-3833及其聚合物共轭物处理。实验结束，胰蛋白酶-EDTA溶液脱离皿底细胞，PBS洗两次，用Apoptosis Detection Kit（BD Biosciences，美国圣何塞）按说明书用FITC偶联Annexin V染色。洗涤细胞Annexin V结合缓冲液（BD Pharmingen）含1/50体积FITC-Annexin V溶液孵育15 min。样品用适量Annexin V结合缓冲液稀释两倍，立即流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）FL1/FL2（FITC-PI）通道测量。Annexin V单阳性细胞分类为凋亡细胞。

DNA彗星实验

DNA彗星实验碱性条件下进行。每样品1万细胞混入75 μL低熔点琼脂糖（0.5%）。混合后移液覆盖预铺1.5%正常熔点琼脂糖载玻片。样品溶解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris碱、10% DMSO、1% Triton X-100）4°C孵育18 h。室温碱溶液（暗条件）20 min解旋DNA表达碱性易位损伤。电泳（~74 V/cm，30 min）转入水平电泳槽加1×电泳缓冲液（0.3 M NaOH、1 mM EDTA，pH>13）。冰冷100%甲醇固定载玻片干燥。80 μL 1×溴化乙锭（EtBr）染色5 min，冰冷蒸馏水洗除多余染料。显微镜（Carl Zeiss，德国）观察DNA彗星，用‘CASP’软件（Casplab-1.2.3b2，CASPlab，波兰弗罗茨瓦夫）分析图像。每样品计100彗星。按彗星尾大小分五级基因毒性：0（0-5%损伤）、1（5-25%）、2（25-45%）、3（45-70%）、4（>70%损伤）[32]。损伤指数（DI）按前文计算 [33]。

甲基绿染料DNA嵌入实验

用甲基绿实验 [34] 考察Les-3288和Les-3833嵌入DNA分子能力。鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）37°C孵育1 h加15 μL甲基绿溶液（1 mg/mL水中）。化合物1 μg/mL加入37°C暗孵育2 h。样品总终体积1 mL。BioTek 76 883多通道微光度计（BioTek，美国温诺斯基）37°C孵育2 h后630 nm测甲基绿吸收。EtBr作阳性对照。

数据分析与统计

所有实验重复三次，每变体三平行。方差分析（ANOVA）用于组间比较。C6大鼠胶质瘤细胞细胞周期不同阶段分布数据单因素ANOVA后Tukey事后多重比较检验。所有数据呈均值±SD。p<0.05视为统计学显著。

结果

4-噻唑烷酮衍生物游离形式与聚合物纳米载体复合形式细胞毒性（台盼蓝排除实验）

台盼蓝排除实验结果显示Les-3288和Les-3833与PNC复合物水基形式对胶质瘤C6细胞毒性增强（24 h和48 h处理），超越游离形式化合物细胞毒性（图5、6）。Les-3288和Les-3833复合物0.1和0.5 μM剂量观察到最高细胞毒性，而最高剂量（1.0 μM）仅Les-3288 24 h检测到复合增强（图5、6）。

大鼠胶质瘤C6细胞台盼蓝排除实验存活数：24 h和48 h不同浓度（0.1、0.5、1.0 μM）Les-3288单独作用vs其与聚合物纳米载体（PNC）复合物作用 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (vs对照，100%)

大鼠胶质瘤C6细胞台盼蓝排除实验存活数：24 h和48 h不同浓度（0.1、0.5、1.0 μM）Les-3833单独作用vs其与聚合物纳米载体（PNC）复合物作用 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (vs对照，100%)

Les-3833和Les-3288与聚合物纳米载体复合增强体外大鼠胶质瘤C6细胞促凋亡活性

用两替代法评估PNC对选定4-噻唑烷酮衍生物细胞毒潜力调节效应。首先细胞周期分析考察药物-PNC复合物对细胞周期影响。此外Annexin V/PI双染色区分这些纳米复合物诱导细胞死亡准确类型。

Les-3288和Les-3833低剂量（0.1和0.5 μg/mL）对细胞周期进程或凋亡诱导无明显影响（图7、表1）。然而两化合物与PNC复合显著增加预G₁期细胞数（Les-3288增4倍、Les-3833增6倍），指示促凋亡潜力大幅提升。应强调游离PNC无细胞周期或凋亡诱导影响；因此噻唑烷酮-纳米载体复合物处理下大量预G1细胞出现不能用PNC与实验药物简单协同效应解释。

4-噻唑烷酮衍生物Les-3288和Les-3833游离形式和与聚合物纳米载体（PNC）复合形式对C6大鼠胶质瘤细胞细胞周期进程影响。碘化丙啶（PI）染色，流式细胞术。R2，预G1；R3，G1；R4，S；R5，G2期。FL2-H，流式细胞仪第二通道（585/40滤光片）峰值发射值

为确认观察到的亚G1峰由凋亡细胞组成，分析Annexin V/PI染色实验结果。C6胶质瘤低剂量（0.1和0.5 μg/mL）和高剂量Les-3288（1.0 μg/mL）处理未观察到磷脂酰丝氨酸外翻（早期凋亡主要标志，FITC-Annexin V检测）显著外化，提示该化合物为弱凋亡诱导剂。反之发现坏死细胞群增加（对照1.2%至Les-3288 1.0 μg/mL时11.25%），可能指示Les-3288至少部分致坏死细胞死亡。然而Les-3288与PNC复合完全改变药物作用模式。早期凋亡（Annexin V(+)/PI(−)）和晚期凋亡细胞（Annexin V(+)/PI(+)）大幅增加，纯坏死细胞总量维持对照（未处理）水平（图8a）。因此Les-3288与PNC结合不仅强烈增强其对胶质瘤细胞促凋亡活性，还降低其潜在促坏死细胞死亡机制。这些发现对临床实践可能关键，因促坏死药物因大量诱导炎症对患者不便不推荐使用。

Les-3288（a）和Les-3833（b）化合物及其与聚合物纳米载体（PNC）复合物对大鼠胶质瘤C6细胞促凋亡活性对比。Annexin V/PI双染色，流式细胞术。PI，碘化丙啶

令人惊讶Les-3833+PNC复合物未观察到相同效应。事实上Les-3833+PNC复合物促凋亡活性在所有测试浓度下均低于游离Les-3288（图8b）。两化合物巨大差异可能由化学结构特异性解释，我们推测Les-3833情况聚合物结构应优化以获更好结果。

4-噻唑烷酮衍生物游离形式与PNC复合形式致大鼠胶质瘤C6细胞DNA损伤彗星实验

碱性彗星实验允许检测碱性易位DNA位点单链断裂。用Olive尾矩（OTM）平均值估计结果。数据显3 h处理（图9、10）Les-3288、Les-3833、PNC（浓度0.5 μg/mL）未致显著DNA损伤（OTM=0.7299±0.1276、1.466±0.3086、0.5846±0.1078），对照未处理细胞OTM=0.4541±0.07273。但Les-3833+PNC复合物处理（OTM=2.3880±0.2212）致比游离Les-3833更显著DNA损伤。Les-3288+PNC复合物未观察此类损伤增加（图9、10）。

大鼠胶质瘤C6细胞0.5 μg/mL浓度实验抗肿瘤化合物处理3 h DNA损伤用Olive尾矩评估。*P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001. PNC，聚合物纳米载体；Dox，阿霉素（阳性对照）

大鼠胶质瘤C6细胞处理3 h后彗星尾DNA存在：（a）对照（未处理），Les-3288（b），Les-3288+PNC（c），Les-3833（d），Les-3833+PNC（e），PNC（f），阿霉素（g），0.5 μg/mL浓度

细胞孵育时间增至6 h（图11、12）所有实验组DNA损伤加重：Les-3288、Les-3288+PNC、Les-3833、Les-3833+PNC、Dox（阳性对照）。但Les-3288+PNC和Les-3833+PNC复合物效应似低于游离Les-3288和Les-3833效应。应注意两衍生物与PNC复合物DNA损伤效应低于游离形式衍生物。

大鼠胶质瘤C6细胞0.5 μg/mL浓度实验抗肿瘤化合物处理6 h DNA损伤用Olive尾矩评估。*P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001. PNC，聚合物纳米载体；Dox，阿霉素（阳性对照）

大鼠胶质瘤C6细胞处理6 h后彗星尾DNA存在：（a）对照（未处理），Les-3288（b），Les-3288+PNC（c），Les-3833（d），Les-3833+PNC（e），PNC（f），阿霉素（g），0.5 μg/mL浓度

用TailDNA%平均值评估结果。数据显3 h孵育（图13）Les-3288、Les-3288+PNC、Les-3833、PNC（均0.5 μg/mL）不导致显著DNA损伤（TailDNA%：4.157±0.682；3.530±1.012；8.807±0.878；3.298±0.514）对照TailDNA%=3.638±0.406，但Les-3833+PNC复合物（TailDNA%=19.53±1.48）致比游离Les-3833更显著DNA损伤。孵育时间增至6 h（图14）所有情况DNA损伤加重。同样，两衍生物与PNC复合物作用检测TailDNA%水平低于游离形式衍生物作用水平。

大鼠胶质瘤C6细胞0.5 μg/mL浓度实验抗肿瘤化合物处理3 h DNA损伤用彗星尾DNA%评估。*P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001. PNC，聚合物纳米载体；Dox，阿霉素（阳性对照）

大鼠胶质瘤C6细胞0.5 μg/mL浓度实验抗肿瘤化合物处理6 h DNA损伤用彗星尾DNA%评估。*P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001. PNC，聚合物纳米载体；Dox，阿霉素（阳性对照）

我们也用替代五类分类系统分类DNA迁移计算DI。表2总结3 h处理大鼠胶质瘤C6细胞各基因毒性水平百分比。对照（未处理细胞）检测到较高0级（81.3%）和1级（18.6%）细胞百分比，超Les-3288和PNC处理细胞这些水平。Les-3288与PNC复合未导致DNA彗星分布模式大变化。相反Les-3833处理细胞显0级百分比较低（38.6%）、1级较高（60.0%），而Les-3833+PNC处理细胞显著更低0级（8.0%）和更高1级（76.0%）、2级（13.3%）、3级（2.6%）。应用Les-3288及其PNC复合物DNA损伤综合指标（DI）与对照或游离PNC无显著差异，而应用Les-3833及其PNC复合物DI甚至高于Dox。

此期间Les-3833+PNC处理细胞显示4级（5.3%）DNA损伤细胞百分比高于Les-3288和其他实验化合物处理细胞，但2、3级百分比（16.0%、12.0%）低于其他化合物处理（表2）。表3总结6 h处理大鼠胶质瘤C6细胞DNA损伤百分比。总体检测到Les-3833和Les-3288复合物使用时倾向出现更高级DNA彗星，相较游离形式这些药物诱导DNA彗星谱（表3）。然而应用Les-3833和Les-3288复合物计算DNA损伤综合指标（DI）发现低于游离形式这些药物作用指标。可能解释：6 h研究药物作用DI水平极高，甚至高于Dox作用指标水平（表3）。因此观察到Les-3833和Les-3288复合物DNA损伤时间依赖性：3 h处理时Les-3833复合物作用DI较游离Les-3833增加；但6 h处理时两衍生物复合物作用DNA损伤较游离形式减少。PNC作用无显著时间依赖性，而Dox作用显著时间依赖（3至6 h）DI增加（41.2±0.40至185.2±0.23）。

4-噻唑烷酮衍生物Les-3288和Les-3833 DNA嵌入

Les-3288和Les-3833化合物显示嵌入DNA分子一定能力，分别约15%和10%置换甲基绿染料。EtBr作为著名DNA嵌入剂作阳性对照，置换甲基绿染料效率高得多（70%）（图15）。因此Les-3288和Les-3833无法有效嵌入双链DNA两互补碱基对间。

Les-3288和Les-3833化合物（1.0 μg/mL）及阳性对照乙溴（EtBr）置换嵌入鲑鱼精子DNA甲基绿染料

讨论

阻碍提高癌症患者治疗效率有两主要问题：（1）许多抗癌药非靶向作用导致全身毒性和严重负面副作用，因正常组织器官损伤；（2）肿瘤细胞对应用抗癌药快速（6-12个月）产生耐药性导致药物作用疗效丧失。此外存在第三技术问题：许多抗癌药水溶性差。但将这些药物与特定纳米尺度载体结合可帮助解决溶解度问题。

本研究通过（a）选择新型合成物质（4-噻唑烷酮衍生物：Les-3288和Les-3833）具高抗癌活性和肿瘤负荷动物较低全身毒性 [7, 8, 23] 和（b）应用新型药物递送平台提供稳定水基形式水不溶性4-噻唑烷酮衍生物与PEG化聚合物复合物，解决上述第一和第三问题。

4-噻唑烷酮衍生物——Les-3288和Les-3833——分子量400-600 Da杂环化合物。这些及其他相关衍生物在利沃夫国立医科大学（乌克兰）合成，多数在国家癌症研究所发展治疗项目（美国马里兰州贝塞斯达）评估 [35-38]。基于抗肿瘤活性评价，选最有前景物质进一步研究细胞毒作用机制和抗癌效应 [25]。Les-3833对B16F10、WM793、SK-Mel-28黑色素瘤细胞、人肺A549、乳腺MCF-7、结肠HCT116、卵巢SKOV3癌细胞和白血病细胞（L1210、Jurkat、HL-60系）显高毒性 [23, 25, 39]。Les-3288和Les-3833对哺乳动物胶质瘤细胞（C6、U251、U373系）显高毒性 [23, 24]。

早前发现Les-3288和Les-3833在研究其他4-噻唑烷酮衍生物中对大鼠C6胶质瘤和人U251胶质母细胞瘤细胞毒性最强 [23, 24]，但因绝对水不溶性应用细胞处理极复杂。仅用DMSO额外加热有效制备衍生物可溶形式（见“材料方法”节）。故合理寻找改善这些衍生物递送靶细胞途径，我们用合成PNC完成此任务。研究4-噻唑烷酮衍生物与应用PNC复合也增强其抗肿瘤作用效力。这些化合物促凋亡作用机制经Western blot和FACS分析证实 [23, 24]。应注意健康实验动物中Les-3288和Les-3833产生负面副作用如心脏毒性 [40]、肝毒性 [8]、肾毒性 [7] 远少于广泛用抗癌化疗药Dox。

早前研究显Les-3288体外促凋亡作用中不诱导ROS产生，相反Dox和Les-3833 [23]，而Les-3833作用导致ROS产生但少于Dox。ROS被视为抗癌药负面副作用主要效应因子，特别是Dox [41, 42]。因此Les-3288和Les-3833化合物可成前景抗癌药，因具抗肿瘤活性但不显示Dox特征有效抗癌药水平全身毒性。

推广Les-3288和Les-3833作抗癌药巨大障碍是其差水溶性。此问题其他抗癌药如紫杉醇类也存在 [2, 4]。紫杉醇用特殊油制备药用制剂解决此问题 [2, 4, 43]。但特定递送平台被认为更有前景创造具生物体有效作用“智能”药 [3, 13]。含PEG嵌段、梳状、嵌段/支链结构功能聚合物表面活性剂及衍生水形式在利沃夫理工国立大学有机化学系开发提议作Dox [26, 27]和金属化疗药KP-1019 [10]载体应用。

因4-噻唑烷酮衍生物不溶水化合物，用DMSO制备水溶形式。为避免DMSO等有毒溶剂负面后果，我们将这些衍生物与上述PNC复合。获得高分散稳定纳米级水分散体并应用处理大鼠胶质瘤C6细胞。

使用4-噻唑烷酮衍生物与PNC复合物导致实验动物这些化合物全身毒性降低。早前发现实验抗肿瘤药（Les-3288、Les-3833、Les-3882）以合成聚合物载体复合形式应用时，其作用伴随血清生化参数变化特征性心脏毒性 [40]、肝毒性 [8]、肾毒性 [7] 远小于Dox。因此这些抗肿瘤药与PNC复合、以水溶性稳定递送系统形式应用降低实验动物毒性效应，相较游离形式物质 [44]。紫杉醇递送系统提议包括聚合物纳米粒子、脂质基制剂、聚合物共轭物、无机纳米粒子、碳纳米管、纳米晶体、环糊精纳米粒子 [43]。

因此Les-3288与PNC复合显著增强该实验药促凋亡活性，允许推进动物肿瘤模型临床前研究。Les-3833同类纳米载体复合效率较低，故应用另型聚合物。

开发水基复合物形式及游离衍生物应用处理大鼠胶质瘤C6细胞。发现PNC与4-噻唑烷酮衍生物——Les-3288和Les-3833——复合物水基形式增强这些化合物促凋亡作用。另一研究我们证实Les-3288诱导凋亡未伴随ROS诱导，相反Dox和部分Les-3833 [23]。因此Les-3288高抗肿瘤活性连同靶向NK/Ly淋巴瘤负荷小鼠恶性肿瘤时低全身毒性暗示该实验抗癌化合物巨大潜力。呈现数据也预测Les-3288和Les-3833与PNC复合物用于胶质瘤治疗潜在用处。

细胞分裂、分化、死亡是调节多细胞生物组织稳态主要生理过程。基因组完整性破坏和细胞死亡调控受损均可导致细胞不受控生长。受损细胞死亡过程也可促进基因组不稳定。细胞周期和细胞死亡过程失调在癌症、心血管疾病、感染、炎症、神经退行性疾病等重大疾病发展中起关键作用日益清晰 [45]。

我们发现一些4-噻唑烷酮衍生物即Les-3288和Les-3833在大鼠C6胶质瘤和人U251胶质母细胞瘤细胞体外诱导凋亡甚至超Dox效果 [23, 24]。应注意脑肿瘤属最耐应用化疗恶性肿瘤，患者生存率极低 [44]。

已显示与此PNC复合增强4-噻唑烷酮衍生物（Les-3288和Les-3833）促凋亡作用 [44]。另一研究 [23] 我们证实Les-3288诱导凋亡未伴随ROS诱导，相反Dox和部分Les-3833。这些数据可解释Les-3288较Dox低全身毒性 [23, 24]。

FACS分析结果支持：研究4-噻唑烷酮衍生物促凋亡作用增强因其与新型PNC复合。Les-3288和Les-3833此类复合增加处理大鼠胶质瘤C6细胞群体预G1细胞比例、降低G1细胞比例、增加G2/M细胞作用。这些数据提示研究衍生物与PNC复合增强细胞毒作用（凋亡）和细胞静滞作用（G2/M期细胞周期阻滞）。总体而言，Les-3288+PNC复合物和Les-3833+PNC复合物凋亡机制杀灭胶质瘤细胞经FACS分析Annexin V单阳性大鼠胶质瘤C6细胞出现证实。

研究4-噻唑烷酮衍生物作用涉及凋亡机制也经DNA彗星实验结果确认。发现Les-3833与PNC复合导致大鼠胶质瘤C6细胞“0”DNA彗星比例降低（相较游离Les-3833）、“1”、“2”、“3”彗星比例同步增加（3 h细胞处理）。6 h Les-3833+PNC复合物处理时“1”彗星比例大增（相较游离Les-3833）、“4”彗星（最高DNA损伤表达）细胞比例增加，“2”、“3”彗星比例降低。应注意Les-3288和Les-3833 6 h DNA损伤效应高于这些衍生物与PNC复合物效应（见表3）。可能解释：6 h研究药物作用DI水平极高，甚至高于Dox作用DI水平（表3）。PNC作用无时间依赖性，而Dox作用显著时间依赖（3至6 h）DI增加（41.2±0.40至185.2±0.23）。

因此4-噻唑烷酮衍生物——Les-3288和Les-3833——与PNC复合增强这些化合物对大鼠胶质瘤C6细胞细胞毒效应，该效应通过凋亡机制实现，含电泳细胞观察到DNA彗星DNA损伤。

用DNA嵌入测试考察4-噻唑烷酮衍生物直接靶向DNA，揭示仅弱置换甲基绿染料（Les-3288和Les-3833分别15%和10%置换）嵌入鲑鱼精子DNA，对比阳性对照EtBr置换（70%）。

因此，因使用4-噻唑烷酮衍生物——Les-3288和Les-3833——与新型PNC复合水基形式，体外细胞毒实验更便利。此外我们证实新型合成4-噻唑烷酮衍生物（Les-3833和Les-3288）对移植BALB/C小鼠NK/Ly淋巴瘤具体内治疗效果，效果可比Dox。同时这些衍生物作用导致动物血液红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量变化和血清天冬氨酸和丙氨酸氨基转移酶活性变化测得负面副作用远少于Dox。

结论

Les-3288和Les-3833与含PEG PNC复合增强其对大鼠胶质瘤C6细胞细胞毒作用。细胞毒作用经凋亡机制实现，经FACS分析预G1分数存在于大鼠胶质瘤C6细胞和Annexin V单阳性细胞证实。DNA彗星分析揭示处理胶质瘤C6细胞核DNA单链断裂，可能非研究化合物嵌入DNA分子所致。Les-3288和Les-3833经两性含PEG PNC稳定形成水基形式，提供体外抗肿瘤效应增强，相较药物游离形式。

缩写

DMSO:

二甲亚砜

Dox:

阿霉素

EtBr:

溴化乙锭

FACS:

荧光激活细胞分选

ROS:

活性氧

PBS:

磷酸缓冲盐水

PEG:

聚乙二醇

PI:

碘化丙啶

PNC:

聚合物纳米载体

SEM:

扫描电镜

TEM:

透射电镜

VEP:

2-叔丁基过氧基-2-甲基-5-己烯-3-炔