优化羟基数量的水溶性富勒醇增强双光子光动力灭菌效果

摘要

本研究成功制备了水溶性富勒醇[C₆₀(OH)₄₆]，其具有高单线态氧量子产率并高效产生活性氧（ROS）。与羟基含量较低的C₆₀(OH)₂₁相比，暴露羟基更多的C₆₀(OH)₄₆表现出更优的双光子稳定性和特性，可作为高效双光子光敏剂。在双光子光动力治疗中，水溶性C₆₀(OH)₄₆以极低能量（211.2 nJ/pixel，800次扫描，760 nm激发）对大肠杆菌展现出强抗菌活性，实现近100%灭菌。

引言

过去几十年合成了多种光敏剂（PS），但临床应用面临挑战：多数PS疏水易在水介质中聚集降低量子产率，难以静脉注射；且需选择性富集病变组织以避免损伤正常细胞。开发高效PS载体仍是光动力治疗（PDT）难题，纳米载体研究日益受关注。

纳米生物技术推动了全碳纳米结构——富勒烯C₆₀（直径0.72 nm球形分子）的生物医学应用。C₆₀无毒，其小尺寸赋予与生物分子立体相容性，易整合进膜疏水区。延伸π共轭体系使C₆₀吸收紫外-可见光，产生ROS且单线态氧量子产率（Φ_Δ)近100%，可作为PDT光敏剂。但C₆₀极难溶于极性溶剂，限制医学应用。利用双键化学修饰引入亲水基团可制备水溶性衍生物，拓展神经保护、药物/基因递送、光敏、生物传感等应用。

双光子激光显微镜利用局域“非线性”激发仅在薄扫描平面激发荧光，常配合近红外（NIR）激光：NIR散射小、吸收低、穿透深、光漂白少，成为厚组织/深层生物样品荧光成像首选，也广泛用于其他光激发治疗。双光子技术因超低能量和短激发脉冲被视为PDT替代方案。高Φ_Δ PS优先用于PDT，尤其双光子技术评估分子光学活性时，高Φ_Δ有利于最小化光损伤。但鲜有研究探讨双光子性质材料用于PDT。本研究利用水溶性羟基化富勒醇的强电子给体能力和大π共轭体系提升电荷转移效率，增强双光子性质。具体制备水溶性C₆₀(OH)₄₆作为双光子PS，在超低能量飞秒激光（211.2 nJ/pixel，功率2.112 mW，800次扫描，760 nm激发，总有效曝光~3.2621 s，扫描速率4.0776 ms/次，扫描面积200×200 μm²）下，实现大肠杆菌（革兰氏阴性）近100%清除。此外，高羟基组分C₆₀(OH)₄₆双光子光学性质优于低羟基组分，显示其作为双光子PDT消除致病微生物的巨大潜力（图1）。

材料与方法

水溶性富勒醇C₆₀(OH)₂₁和C₆₀(OH)₄₆的制备与表征

商业C₆₀（Sigma-Aldrich）制备C₆₀(OH)₁₂前驱体。30% H₂O₂（100 mL）加入0.5–1.0 g C₆₀(OH)₁₂，60℃剧烈搅拌。冷却后加入异丙醇、乙醚、正己烷混合溶剂（各100–200 mL），离心弃上清。残留固体经乙醚洗涤两次（离心弃上清）。真空干燥得水溶性C₆₀(OH)₂₁和C₆₀(OH)₄₆。热重分析校准产物重量。高分辨透射电镜（HR-TEM，JEOL 3010）观察形貌，分辨率分别约1.11±0.03 nm和1.13±0.04 nm。动态光散射（DLS，Malvern Nano-ZS90）测粒径。傅里叶变换红外光谱（FTIR，RX1，PerkinElmer）分析表面官能团。UV-vis光谱（U-4100，Hitachi）表征。X射线光电子能谱（XPS，PHI 5000）分析表面化学。场解吸质谱（FD-MS，AccuTOF GCx-plus，JEOL）测定分子量，确认羟基数分别为21和46。

细菌培养

E. coli源自本实验室，LB琼脂平板（每升：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 8 g，琼脂15 g，pH 7.5），37℃培养。

菌落形成单位（CFU）计数法生物相容性测定

E. coli（OD₆₀₀~0.05）加入材料（0–9 μg/mL），37℃孵育3 h（附件1：图S1）。离心收集菌体，稀释至OD₆₀₀~0.05，梯度稀释10⁻⁵–10⁻⁸涂平板，37℃过夜。计数存活菌，以CFU/mL百分比表示。数据为均值±SD（n=6）。

单线态氧量子产率（Φ_Δ)测定

参考文献[29,30]法，在D₂O中355 nm激发，以间位四(4-磺酸苯基)卟啉二氯化物（TSPP，Φ_Δ=0.64）为参比。

荧光量子产率测定

相对光致发光（PL）量子产率公式：

$$ \text{QY} = \text{QY}_{\text{ref}} (\eta^2/\eta_{\text{ref}}^2)(I/A)(A_{\text{ref}}/I_{\text{ref}}) \tag{1} $$

参比Cy5.5/DMSO QY_ref=0.28，ddH₂O折射率η=1.33（DMSO η_ref=1.48），I为积分荧光强度，A为激发波长吸光度。单光子激发（OPE）和双光子激发（TPE）产生相同QY。

飞秒激光光学系统：双光子吸收（TPA）与双光子发光（TPL）测量

自制飞秒钛蓝宝石激光系统（80 MHz重频；Tsunami，Spectra-Physics）。

TPA测量

振镜扫描速度2 m/ms，激发光谱720–820 nm，激发功率2.8 mW（物镜前；物镜后功率0.9856 mW或98.56 nJ/pixel）。测定富勒醇相对TPA光谱。

TPL光谱测量

760 nm激发，扫描面积200×200 μm²，10 kHz频率，曝光1.638 s/(scan, pixel)=100 μs，128×128像素/扫描，像素面积1562.5×1562.5 nm²。聚焦光斑面积πd²/4，d=0.61λ/NA为光腰半峰全宽。40×油镜（NA 1.3）下，760 nm激发时d=0.61×800/1.3=375.38 nm=0.37538 μm，z轴分辨率0.90159 μm。单次扫描曝光时间=(光斑面积/像素面积)×100=4.0776 ms，总曝光t=4.0776 ms×扫描次数。40×油镜（NA 1.3）收集信号，光谱仪检测范围300–695 nm。

激光功率计算：40×油镜（NA 1.3）下760 nm透射率约88%，光路损耗仅剩输出功率40%。样品上能量=P_output×40%×88%=0.352×P_output。10 kHz扫描（每脉冲0.1 ms/pixel），样品上单像素能量=P_output×0.0352。如P_output=2.8 mW，样品上功率0.9856 mW，能量98.56 nJ/pixel。全文均标注样品上功率。

TPE绝对截面测定

参考文献[24,36–48]法，飞秒激光系统测TPL信号验证荧光素和罗丹明B截面。结果见图1b：激发功率704–2816 nJ/pixel（7.04–28.16 mW）下，荧光素和罗丹明B指数分别为2.03和2.02，确认二次非线性依赖。参考Prof. Chris Xu数据（https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html），荧光素和罗丹明B在760 nm下作用截面分别为36.4和68.0 GM（1 GM=10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹）。本测得值为36.5和66.1 GM，误差<5%。以罗丹明B为标准，计算水溶性C₆₀(OH)₂₁和C₆₀(OH)₄₆ TPE绝对截面分别约1230.51 GM和1037.21 GM。测量参数见表1。材料批次间双光子性质和PDT能力无差异。

飞秒激光系统：荧光寿命成像显微镜（FLIM）

同款自制飞秒钛蓝宝石系统（80 MHz）。三指数拟合分析TPE（激发760 nm）下发射寿命数据。

辐射与非辐射衰减率计算

PL量子产率Q和寿命τ是探究荧光发射特性的关键参数：

$$ Q = \frac{\Gamma}{\Gamma + k} \tag{2} $$ $$ \tau = \frac{1}{\Gamma + k} \tag{3} $$

其中Γ为辐射衰减率，k为非辐射衰减率。由式(2)(3)计算两者。光子吸收将电子激发至高能级S₁（亚稳态），通过辐射跃迁发射荧光或非辐射释热回基态S₀。荧光寿命τ是电子在S₁平均停留时间，等于所有激发态去活化速率常数之和的倒数。k=k_ic（内转换）+k_isc（系间窜越）。Kasha规则：发射总从S₁最低振动能级发生，OPE和TPE产生相同光谱、QY和寿命。

激光照射后细菌存活率测定

CFU计数法

E. coli（OD₆₀₀~0.05）加材料（3或6 μg/mL），37℃避光孵育3 h。离心稀释至OD₆₀₀~0.05，经TPE照射（211.2 nJ/pixel，800次扫描，~3.2621 s，760 nm）。梯度稀释涂平板，37℃过夜计数，以CFU/mL百分比表示。数据为均值±SD（n=6）。

LIVE/DEAD试剂盒法

同前处理至TPE照射。SYTO 9（绿荧光，活菌）/碘化丙啶（PI，红荧光，死菌）染色（Thermo Fisher），按说明书量化活菌率。结果显示材料处理组经光照后几乎全死，与CFU法一致，证实PDT高效抗菌。数据为均值±SD（n=6）。

ROS检测

单线态氧（¹O₂）

(a) 材料（3或6 μg/mL）与E. coli（OD₆₀₀~0.05）孵育3 h（37℃，避光），TPE照射（211.2 nJ/pixel，800次，760 nm），加单线态氧绿探针（SOSG，1 μM，Ex/Em 488/525 nm），荧光光谱仪测定。ROS中和实验：加30 ppm抗氧化剂α-生育酚/亚油酸甲酯（Sigma）避光孵照同条件照射。(b) 同前，改用反式-1-(2'-甲氧基乙烯基)芘（t-MVP，10 μM）/0.10 M SDS（Ex/Em 352/465 nm）。t-MVP与¹O₂反应生成荧光二恶烷中间体，高选择性不与羟基自由基、超氧阴离子、过氧化氢反应。ROS中和同法。

超氧阴离子（O₂^•−）

(a) 材料+菌孵育3 h，TPE照射，加XTT（0.45 mM，Sigma）。XTT与O₂^•−反应生成强吸收（470 nm）的甲瓒，UV-vis监测。ROS中和：加30 ppm α-生育酚/亚油酸甲酯避光同照射。(b) 材料+菌孵育，TPE照射，加50 mM碳酸氢盐缓冲液（pH 8.60）和谷胱甘肽（GSH，γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸）/0.80 mM碳酸氢盐（Ellman法检测O₂^•−）。按文献步骤实验。GSH损失率=(样品吸光度-阴性对照吸光度)/阴性对照吸光度。数据为均值±SD（n=6）。

摄取实验

E. coli（OD₆₀₀~0.05）与3 μg/mL材料孵育。UV-vis记录材料初始吸光度（~203 nm）。材料与菌混合于37℃，第1–10 h分别取样离心（1200 rpm）取上清测吸光度。吸光度差计算各时间点摄取百分比。数据为均值±SD（n=6）。

统计分析

方差分析（ANOVA）检验显著性，p值对所有处理均具有统计学意义。

结果与讨论

水溶性富勒醇表征

水溶性C₆₀(OH)₄₆呈圆形单分散（图2a低倍、2b高倍TEM），平均侧向尺寸约1.13±0.04 nm，晶格条纹清晰，d间距0.213 nm对应{1^¯100}晶面。水溶液（pH 7.0）中可通过氢键形成~130 nm聚集体（DLS），在pH 7.0水、1×PBS、培养基中稳定3个月以上（附件1：表S1）。UV-vis吸收峰约216 nm（芳香C=C π–π*跃迁）和309 nm（C=O肩峰 n–π*跃迁），含氧π电子跃迁确认富勒醇存在（图2c）。FTIR、XPS、质谱进一步确证。FTIR显示特征带：1109 cm⁻¹（C–O伸缩，带1）、1271 cm⁻¹（酚羟基C–OH，带2）、1422 cm⁻¹（叔醇C=O，带3）、1674 cm⁻¹（C=C，带4）、1721 cm⁻¹（C=O，带5）、3318 cm⁻¹（C–H分子间氢键/羧酸盐O–H，带6），另见CO₂干扰带（图2d），确证暴露羟基/羰基及芳香C=C键。XPS去卷积C(1s)谱显示非含氧环（C–C/C=C，286.1 eV）、C–O键（286.9 eV）、C=O键（288.0 eV），O(1s)/C(1s)原子比约35.8%（图2e）。FD质谱确认分子量，羟基数46（附件1：图S2），与原子比和键合组成一致。表征确认合成成功。

TPE下水溶性富勒醇ROS生成

PS吸收光能转移予非吸光分子产生ROS，杀灭靶细胞、破坏肿瘤血管、激活抗肿瘤免疫。PS基态为单线态，电子成对占据低能轨道。吸收光子将电子激发至高能轨道（自旋不变），形成短寿命（纳秒级）激发单线态S₁，可通过荧光或放热回基态。或发生系间窜越（电子自旋翻转），形成长寿命（微秒级）激发三线态T₁。三重态-单重态辐射跃迁因需翻转自旋而受抑。从T₁可磷光发射、能量/电子转移予分子氧产生ROS（¹O₂、O₂^•−），或通过内转换/非辐射碰撞失活。T₁寿命越长，碰撞产生ROS概率越高[57–59]。水溶性富勒醇光敏化进入长寿命T₁态，能量/电子转移予氧气生成¹O₂和O₂^•−，在PDT中起主导作用。因此需直接激光照射检测C₆₀(OH)₄₆产生的¹O₂和O₂^•−。本研究结合三重态C₆₀(OH)₄₆、氧气、适宜波长/能量光及SOSG、t-MVP、XTT、GSH探针[33,34,49–51]启动PDT检测ROS。760 nm为C₆₀(OH)₄₆ TPE下相对最大TPA比波长（图3a），归因于带间跃迁[52]，后续实验均用此波长。C₆₀(OH)₄₆经TPE激发（211.2 nJ/pixel，800次，760 nm，总曝光~3.2621 s），给药3或6 μg/mL（附件1：表S2）。为确认ROS参与PDT，用α-生育酚中和ROS[49,53]，ROS量减少、菌存活率升高符合预期。ROS产量随给药剂量增加。为防白光误照产生ROS干扰[60]，后续PDT均在暗室进行。重点考察¹O₂和O₂^•−量。C₆₀(OH)₄₆显著抗菌，展现PDT应用潜力。同条件下C₆₀(OH)₂₁（附件1：图S3、S4、图3a）产生¹O₂和O₂^•−效率较低（附件1：表S2）。C₆₀(OH)₄₆产生更多ROS，Φ_Δ约0.93，C₆₀(OH)₂₁约0.85（参比TSPP/D₂O Φ_Δ=0.64[29,30]）。

TPE下抗菌能力测定

抗菌实验前先测材料毒性（排除非光动力杀菌因素），并暗室操作（防白光诱导ROS干扰[35]）。以革兰氏阴性E. coli为模板。CFU计数法测定存活菌百分比（对应CFU/mL）。菌体加两种富勒醇（0–9 μg/mL），37℃避光孵育3 h测OD₆₀₀（初始0.05，随时间增至~0.37），两材料均不抑制菌增殖（图3b），存活率近100%（图3c），生物相容性极佳。因此3 h避光孵育后的材料-菌复合物用于后续实验。为排除材料与ROS探针（SOSG、t-MVP、XTT、GSH）直接反应产生假阳性[52]，引入菌体共孵育后再照射检测ROS。表2显示ROS量趋势与附件1表S2–S3（材料单独、材料+革兰氏阳性B. subtilis）一致，且与1270 nm¹O₂磷光信号吻合（图3d）。

PDT实验：211.2 nJ/pixel，800次扫描（~3.2621 s），760 nm激发。菌单独（有/无光）、材料+菌无光照均无杀菌效果（图4a）。TPE后：C₆₀(OH)₂₁组存活率~15%（~0.823 log₁₀减少，图4b）；C₆₀(OH)₄₆组存活率~0%（100%清除，~7.736 log₁₀减少）。增大剂量至6 μg/mL两材料均完全杀菌（图4c,d）。革兰氏阳性B. subtilis光照后杀菌效果无差异（附件1：图S5）。高羟基组分富勒醇在同等条件下杀菌能力更强。

TEM观察材料处理E. coli及双光子性质研究

选高PDT效率C₆₀(OH)₄₆，TEM观察光照后菌体形态。裸菌正常（图5a）。3 h孵育后材料大量吸附菌表面（图5b），形态正常。摄取实验显示前3 h吸附爆发率~85%（图5c），3–10 h达饱和。材料在菌表面形成外部屏障。但3天孵育后菌体扭曲变形严重（图5d），存活率~18%（0.940 log₁₀减少，图5f；附件1：图S6）。材料吸附包裹阻碍营养吸收，改变膜通透性致渗透压失衡抑菌，即富勒醇经3天孵育具抑菌/杀菌效应。而光激发后3 h孵育菌体（图5e,f；附件1：图S6）呈独特严重受损形态，菌表面无热气泡，排除光热效应（附件1：图S7）。

荧光成像量化存活率（图6）。单独光照菌体大多完好（图6a绿荧光，活菌），符合图5a。材料+光照组死菌红荧光明显（图6b），符合图5e。量化显示材料处理菌近乎完全清除（图6c）。CFU法（图4a,b，5f，附件1：图S6）再次证实C₆₀(OH)₄₆ PD高效抗菌。综合图4–6、表2、表S2：C₆₀(OH)₄₆处理E. coli对光激发更敏感，死亡率更高、ROS生成更多、形态崩解更严重，优于C₆₀(OH)₂₁。

双光子性质方面：TPE绝对截面大有利于非线性显微研究（吸收能量/入射能量通量比高，减少光损伤[39,40]）。双光子成像活体制备和浑浊组织需良好截面[61]。本研究C₆₀(OH)₄₆ TPE绝对截面约1037 GM（760 nm，荧光素为参比[39,40]；图1b、表1、3），C₆₀(OH)₂₁约1230 GM，与文献[62,63]接近。大截面促进双光子过程。C₆₀(OH)₄₆经双光子过程发光（图1b）。相对荧光QY约0.02（参比Cy5.5/DMSO QY_ref=0.28[31]），绝对QY[64]约0.01，OPE与TPE得相同QY[31]。C₆₀(OH)₂₁相对/绝对QY更低（0.06和0.05）。寿命分析：C₆₀(OH)₄₆平均寿命~7.797 ns（观测到0.149、1.775、19.679 ns三指数分量），C₆₀(OH)₂₁~5.251 ns（图7、表4）。C₆₀(OH)₄₆辐射/非辐射衰减率比~0.020（~2.565×10⁶ s⁻¹ / ~1.257×10⁸ s⁻¹），C₆₀(OH)₂₁~0.064（~1.143×10⁷ / ~1.790×10⁸ s⁻¹；附件1：表S4）。这归因于表面羟基诱导电子-空穴对非辐射复合，抑制本征态发射。但边缘羟基可能具有高占据分子轨道，羟基间强轨道相互作用促进系间窜越（而非荧光），生成更多三重态，导致高Φ_Δ并按Jablonski图[65]与氧反应。因此，超低能量、极短时间双光子PDT可高效杀灭致病物种，提供替代方案。

结论

本研究揭示：高羟基组分水溶性富勒醇光学性质优于低羟基组分，可归因于减少激光曝光和用药量。高羟基富勒醇具高TPA、有利TPE绝对截面、高双光子稳定性，可作为双光子PDT的双光子PS。机制可能为：表面羟基诱导电子-空穴非辐射复合抑制本征发射；边缘羟基高占据分子轨道，羟基间强轨道相互作用促进系间窜越效率，生成更多三重态，导致高Φ_Δ并按Jablonski图与氧反应。从而超低能量、极短时间实有效双光子PDT，为临床应用提供可能。