钙钛矿纳米颗粒对气道上皮细胞的毒性研究

介绍

镧锶锰矿 (LSM) 是一种纳米颗粒，具有钙钛矿基晶体结构。它采用“ABO3”的一般形式，其中镧和锶在 A 位，锰在 B。这导致其通式为 La1 − xSrxMnO3，其中 x 代表锶掺杂水平，取决于纳米粒子的应用。 LSM 可以以粉末形式使用，如流延成型、空气/热/等离子喷涂以及燃料电池应用 [1,2,3,4]。

在最近减少污染和创造以氢为基础的经济的努力中，许多研究都集中在固体氧化物燃料电池 (SOFC) [5, 6] 上。反过来，LSM 钙钛矿因其在 SOFC 中作为其最重要的电极材料之一的重要作用而引起了研究的关注 [4, 7]。 LSM 纳米颗粒是球形高表面金属颗粒，呈棕色或黑色结晶粉末。尽管已经对 LSM 的机械和电气特性进行了大量研究 [1, 3, 8, 9]，但很少有研究关注其生物学效应 [10,11,12]。许多纳米粒子已表明有促进粘液分泌和积累的趋势，因此与呼吸系统疾病有关 [13, 14]。对 LSM 纳米粒子的研究显示了生物医学应用的有希望的想法 [15,16,17]。最近，对 LSM 的研究表明其具有抗癌治疗的潜力 [12, 18, 19]。通过正确的合成程序和表面修饰，LSM 有能力成为 MRI 造影剂和热疗剂以及药物载体 [20,21,22]。但是，应在进一步医疗应用之前评估毒性的可能性。钙钛矿的毒性作用研究有限[10, 23]，至今未见有明显毒性作用的报道。

在这项研究中，我们研究了 LSM 纳米颗粒的毒性，同时暴露于原代气管上皮细胞以确定毒性浓度范围。然后我们用荧光显微镜分析了活性氧 (ROS) 的产生和线粒体损伤以及粘液分泌反应 [24]。用细胞色素 C 和 caspase 3 测定法检测有或没有 LSM 纳米颗粒的细胞凋亡进展水平 [25]。

结果和讨论

NPs 表征和细胞活力测定

纳米粒子的毒性取决于其物理特性，例如几何形状、尺寸分布和表面积。在毒性实验之前，使用 SEM 分析了这些特性。 LSM 纳米颗粒表现出明显的表面粗糙度，并分布在各种尺寸的聚集体中，直径约为 35 纳米至 200 纳米（图 1）。

LSM 物理特性的 SEM 图像。单个粒径在35 nm左右，LSM的聚集尺寸从200 nm到几μm不等

在我们之前的研究 [26, 27] 中，我们对气管气道细胞进行了大量的毒性实验 [26, 27]，因此本次生物学研究选择了该细胞系。为了评估 LSM 对气管细胞的总体毒性，进行了比色 CCK8 细胞活力测定 [25, 27]。如图 2 所示；在细胞活力测定中，从 50 到 100 μg/ml 的 LSM 浓度发生了数量巨大的变化。然而，当 LSM 浓度大于 100 μg/ml 时，种群保持在相对稳定的范围内，没有出现显着变化。

增加 LSM 浓度后的气管细胞活力，此处显示为 Log[ng/ml]。使用比色法CCK8细胞活力测定法进行测定，并计算其每浓度增量的平均值。 (n> 6)

ROS和Mucin释放的产生

ROS 的产生会引发细胞凋亡，从而导致纳米颗粒的细胞毒性。根据图 3； ROS 的产生，增加 LSM 的浓度不会极大地影响 ROS 的产生。 250 μg/ml LSM浓度与对照差异最大，但偏差不显着，说明LSM对ROS的产生无显着影响。

增加 LSM 浓度后气管细胞的 ROS 产生。与对照组相比，计算每个 LSM 浓度处理的 ROS 产生比率。 (n> 100)

从图 4;粘液 bata，经过 15 分钟的处理，对细胞活力没有显着影响，并且随着 LSM 浓度的增加，粘蛋白分泌减少。当细胞用 500 μg/ml 的 LSM 处理时，粘蛋白的释放降低至 40%，并且可能在使用更高浓度的 LSM 时进一步降低。这种减少表明LSM对粘液释放具有抑制作用。

增加 LSM 浓度处理 15 分钟后会产生粘蛋白分泌。通过将每个 LSM 浓度与对照组进行比较来计算每个 LSM 浓度的比率。通过ELLA（酶联凝集素测定）进行细胞表面粘蛋白分泌物的评估。 (*:n> 6, p <0.05)

线粒体损伤和细胞凋亡过程

细胞凋亡的早期阶段通常以线粒体损伤为代表。为了分析这种现象，JC-1 染料被用作线粒体膜电位指示剂。 JC-1 染料诱导的强度比与线粒体完整性的丧失相关，根据图 5，随着 LSM 浓度的增加，100 μg/ml LSM 处理后线粒体损伤显着增加。尽管结果表明在 100 μg/ml LSM 处理后线粒体损伤显着，但是 caspase3 和细胞色素 C 显示出轻微的降低，如下详述。该结果表明LSM可能导致线粒体损伤，但细胞仍有能力在凋亡进程中保持低水平并降低凋亡标志物的表达。

JC-1 指示剂染料在四种不同处理条件下对气管细胞的荧光强度结果表明线粒体完整性。 (*, **, ***:n> 100, p <0.05)

也可以通过细胞色素 C 和 caspase 3 的表达来测量细胞凋亡。如图 6a 所示；细胞色素C的细胞凋亡结果显示，不同浓度LSM与对照组的细胞凋亡率均呈中度下降。同样的趋势可以在图 6b 中看到； caspase 3 的细胞凋亡结果，表明 LSM 引起的毒性非常小。总体而言，LSM对气道气管细胞的线粒体损伤和凋亡结果非常低，表明LSM对气管上皮细胞没有明显的毒性作用。

通过a测量细胞凋亡结果 细胞色素 C 表达，b caspase 3 表达。通过与对照 (HBSS) 组相比，每个 LSM 浓度处理获得这些比率。 (*:n> 100, P <0.05)

结论

由于纳米颗粒在工业和商业产品中的广泛应用，最近的纳米毒性研究引起了人们对纳米颗粒毒性作用的广泛关注。纳米毒性的主要问题是由于 ROS 的产生。例如，由于产生大量 ROS 可能导致细胞死亡和突变，TiO2 NPs 被认为是一种致癌物质 [28]。近年来，有多种不同类型的材料和化合物被归类为钙钛矿，这些材料和化合物已被报道用于各种不同的应用。这是第一项确定 LSM 对气道上皮细胞毒性的研究，气道上皮细胞是细胞摄取 NPs 的主要途径之一。本研究旨在研究 LSM 对气管细胞的影响，以评估其毒性。结果表明，LSM 对细胞色素 C 和 caspase 3 表达测量的细胞凋亡进程、JC-1 荧光测量的线粒体完整性、细胞存活和 ROS 产生没有任何显着影响。然而，该处理显示出对粘液分泌的抑制作用，随着 LSM 浓度的增加，粘液产生减少。最终，通过从这项研究中获得的结果，发现 LSM 对气道上皮细胞无毒，不会引起细胞凋亡阶段的显着变化，另外还会降低可能危及细胞活力的粘液分泌。这表明 LSM 有可能干扰气道粘液清除。在我们的研究中，我们证明了 LSM NPs 的潜在毒性，结果表明毒性作用的潜在风险相对低于已用于工业和商业应用的其他 NPs。然而，必须进行进一步的研究以确定 LSM 是否可以作为活性成分安全地加入商业太阳能和储能产品中。

材料和方法

气管原代细胞培养

按照先前公布的方案[26]，从正常牛支气管上皮中分离气管原代上皮细胞。细胞在补充有资格预审的人重组表皮生长因子 1-53 (EGF 1-53) 和牛垂体提取物 (BPE) (Thermo Fisher) 的无血清培养基 (SFM) 中生长和维持。原代气管细胞在胶原蛋白 () 预包被的 15 厘米 Falcon 板中培养，并在 37°C、5% CO2 的加湿培养箱中培养。使用台盼蓝 (Sigma) 排除和 Bright-Line 血细胞计数器进行细胞计数。细胞汇合达到80%时通过。

细胞制备

细胞以5 × 10 ⁴ 接种 用于细胞活力测定的胶原蛋白包被的 96 孔板（75% 汇合）中每孔细胞数，5 × 10 ⁵ Ca ²⁺ 胶原包被的 4 孔板（75% 汇合）中每孔细胞数 信号转导、ROS 和线粒体分析。接种后，将细胞在补充有资格预审的人重组 EGF 1-53 和 BPE（Thermo Fisher）的 SFM 中孵育 24 小时。孵育 24 小时后，从细胞中去除培养基，并用磷酸盐缓冲盐水冲洗培养物两次。用在 Ca ²⁺ 中超声处理的纳米粒子代替 PBS 洗涤 包含 Hanks 或 Ca ^{2 +} - 释放汉克斯。

细胞活力测定

使用 CCK-8 染料（Dojindo Laboratories，Tokyo，Japan）评估细胞毒性的光比色测定 [27, 25]。 CCK-8 是非放射性的，可以比色测定经受不同 NP 浓度的活细胞的百分比。该检测试剂盒测量活细胞内脱氢酶的代谢活性，以将 WST-8 四唑盐转化为水溶性甲臜。它是通过在 HBSS 中以 1:10 稀释度添加 CCK-8 来制备的。用 HBSS 冲洗细胞并将 100 μL 染料加载到每个孔中。然后，将细胞在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养 6 小时。通过使用 Thermo Multiscan EX 读板器（Thermo Multiskan EX 读板器，VWR，CA，USA）在 450 nm（650 nm 参考）的光密度下测量吸光度。从三个独立实验的每个浓度（包括未处理对照）的三个独立数据集计算平均值，并以未处理对照的百分比形式制成表格。

细胞活力的计算公式为 \( \frac{OD_{450\mathrm{treatment}}-{OD}_{650\mathrm{treatment}}}{O{D}_{450\mathrm{control}}-O {D}_{650\mathrm{control}}}\ast 100\% \).

镧锶锰纳米粒子

本研究中使用了镧锶锰 (La0.15Sr0.85MnO3) (LSM) 纳米颗粒（35 nm，99.5%）（Nanostructured&Amorphous Materials Inc.）。所有 NP 样品在使用前都经过超声处理。使用的浓度为 500 μg/ml、250 μg/ml、100 μg/ml 和 50 μg/ml。使用的浓度范围是根据之前报告中发现的 TiO2 NPs 浓度决定的（Dowding 等人，2014 年；Dowding 等人，2012 年；Gurr 等人，2005 年；Hirst 等人，2009 年；Niu 等人，2011 年）。 LSM NPs 在单独测试之前用 Hanks 溶液（Invitrogen，CA，USA）重构，并在使用前立即超声约 5 分钟。

扫描电子显微镜

LSM NPs 被制备成 5 μg/ml 并滴铸在干净的硅片上并风干以去除残留的水。使用扫描电子显微镜（Gemini SEM，Zeiss）独立确认纳米颗粒的大小。

细胞内活性氧的产生

使用 CM-H2DCFDA 染料（Invitrogen，CA，USA）的氧化通过荧光显微镜评估活性氧 (ROS) 的产生 [24]。将细胞（1 × 105 个细胞/孔）培养 24 小时，然后用 PBS 溶液冲洗。通过在培养基中应用含有 2 μM 重构 CM-H2DCFDA 染料的上样缓冲液对样品进行染色 30 分钟。染色的样品用 PBS 洗涤 3 次，并留出 5 分钟的恢复时间，让细胞酯酶水解 AM 或乙酸酯基团并使染料对氧化反应。 Hanks 缓冲液含有浓度范围为 0 至 500 μg/ml 的 LSM NP，浓度为 50 μg/ml，然后与细胞在 37°C 下孵育 15 分钟，然后用 PBS 洗涤。通过计算不同处理组和对照组之间荧光强度增加的比率，捕获并分析细胞中产生的ROS的荧光图像。

线粒体损伤测量

使用多色 5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基-碳氰碘化物 (JC-1 Sigma) [25] 评估线粒体内跨膜电位。 JC-1 是一种亲脂性荧光阳离子，可以结合到线粒体膜中，在那里它依赖于膜电位状态聚集体。聚集会改变 JC-1 的荧光特性，从绿色荧光转变为红色荧光。用 JC-1 染色的完整线粒体膜表现出明显的红色线粒体荧光，可通过荧光显微镜检测到。线粒体膜电位的破坏导致随后绿色荧光减少和红色荧光增加。在 NPs 刺激之前，将细胞用 PBS 洗涤两次，并与 JC-1 染色试剂 (1:1000) 在培养基中在 37°C 下孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤并进行细胞处理。荧光显微镜检测线粒体膜电位，时间间隔为10 min。

测量 [Ca ²⁺ ]c

所有实验均在黑暗条件下进行。用 Rhod-2 AM 染料 (1 μM) (K d =570 nM，λEx =552 nm，并且λEm =581 nm）（Invitrogen，CA，USA）持续 45 分钟。然后用 PBS 洗涤细胞两次，然后用 Hanks 缓冲液孵育，并用适当的 NPs 浓度处理。所有 Ca ²⁺ 信号实验是在安装在尼康显微镜（Nikon Eclipse TE2000-U，东京，日本）上的 37°C 温度调节状态下进行的 [24, 25, 27]（Chen 等人，2011 年）。

粘蛋白分泌和 ELLA

细胞接种于 1 × 10 ⁶ 6 孔板中每孔一个细胞并培养 24 小时。然后用 PBS 冲洗气管原代细胞，并用 PBS 中制备的相应 LSM NP 浓度（500 μg/ml、250 μg/ml 和 100 μg/ml）刺激 15 分钟。收集含有分泌的粘蛋白的上清液并在 8000 rpm 下短暂离心以去除残留的 NP。然后将上清液在 96 孔 (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) 板中在 4°C 下孵育过夜。之后，用 PBST（PBS + 0.05% Tween-20）洗涤 96 孔板，然后用 1% BSA 封闭。 96 孔板再次用 PBST 洗涤，并与凝集素（小麦胚芽凝集素，WGA）（Sigma-Aldrich，MO，USA）一起孵育，结合辣根过氧化物酶（HRP；5mg/ml）（Sigma-Aldrich，MO，美国），在 37°C 下保持 1 小时。在室温下将底物 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB；Sigma-Aldrich，MO，USA）加入到每个孔中，然后加入 H2SO4（Sigma-Aldrich，MO，美国）以终止反应。在 450 nm 处测量光密度（Chen 等人，2011 年；Kemp 等人，2004 年）。

免疫吸附测定 (ELISA) 制备

细胞接种密度为1 × 10 ⁶ 6 孔板中的细胞密度并培养 24 小时。然后用PBS冲洗气管细胞。用在 PBS 中制备的适当 LSM NPs 浓度 (0–500 μg/ml) 刺激细胞 2 小时。细胞裂解液采用Peirce RIPA细胞裂解液试剂制备，收集裂解液转移至微量离心管中。样品以~ 14,000×g离心 15 分钟以沉淀细胞碎片和纳米颗粒。然后将上清液在 96 孔板中在 4°C 下孵育过夜。之后，用 PBST（PBS + 0.05% Tween-20）洗涤 96 孔板，然后用 1% BSA 封闭。将 96 孔板再次用 PBST 洗涤并与兔抗半胱天冬酶 3、活性形式抗体（Millipore，多克隆抗体）和小鼠抗细胞色素 C（Invitrogen，单克隆抗体）在室温下温育 2 小时。然后使用二抗（抗兔和抗小鼠偶联辣根过氧化物酶，HRP，Millipore）并按照与ELLA相同的步骤测量吸光度强度[25]。

图像分析

使用倒置的 Nikon Eclipse TE2000-U 荧光显微镜进行图像分析。每张照片均以 × 10 的放大倍率拍摄，并使用 Simple PCI（Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, USA）进行分析。显示的细胞溶质钙浓度数据由 Rhod-2 荧光表示。每 0.5 秒拍摄一次图像并自动转换为灰度进行分析。简单的 PCI 提供了选定区域的像素强度（平均灰度值），每个区域在纳米粒子刺激后立即在 100 s（~ 200 帧）内每帧具有 200 个细胞的平均荧光。显示的免疫荧光染色数据代表了石墨烯处理 1-2 小时后的蛋白质表达。所有实验均至少独立进行3次验证。

统计分析

数据表示为平均值 ± SD。每个实验至少独立进行 3 次。使用带有 p 的单向方差分析检验分析确定统计显着性 值 <0.05（GraphPad Prism 4.0，GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA）。

缩写

BPE：

牛垂体提取物

ELISA：

酶联免疫吸附试验

LSM：

镧锶锰

ROS：

活性氧

SFM：

无血清培养基

SOFC：

太阳能氧化燃料电池