镧锶锰氧化物纳米颗粒：气道上皮细胞毒性与黏液分泌影响

摘要

纳米颗粒毒性研究随其在日常产品中普及而加剧。某些纳米颗粒可刺激黏液分泌，潜在损害气道完整性。镧锶锰氧化物（LSM）是一种钙钛矿纳米颗粒，因高电导率、氧还原反应的强电化学活性、热稳定性和长期性能，广泛用于固体氧化物燃料电池（SOFCs）。然而，LSM 生物学效应数据有限。本研究将原代气管上皮细胞暴露于高达 500 µg mL⁻¹ LSM。结果显示对细胞活力、活性氧（ROS）产生、细胞色素 C 释放和 caspase-3 表达仅有中等影响。凋亡标志物基本未变，但 LSM 以剂量依赖方式显著抑制黏液分泌。因此，尽管 LSM 对气道细胞细胞毒性低，但其降低黏液产生的能力可能损害气道清除功能。

引言

镧锶锰氧化物（LSM）具钙钛矿晶体结构，通式 La₁₋ₓSrₓMnO₃，x 反映锶掺杂水平。该材料可加工为粉末用于带式铸造、空气/热/等离子喷涂及燃料电池应用。LSM 的高比表面积和电化学性能使其成为 SOFCs 领先电极候选材料，SOFCs 是新兴氢能经济核心。尽管 LSM 机械和电学性能研究广泛，其生物相互作用仍探索不足。许多纳米颗粒已知升高黏液分泌并导致呼吸系统疾病。新兴证据提示 LSM 亦可作药物载体或成像对比剂，但在任何生物医学部署前必须厘清其潜在毒性。本研究评估 LSM 在原代气管上皮细胞中的细胞毒性谱，考察 ROS 生成、线粒体完整性、凋亡和黏液分泌。

结果与讨论

纳米颗粒表征与细胞活力

扫描电镜（SEM）检查表面形貌。LSM 纳米颗粒显示粗糙表面，聚集成簇，尺寸从 ~35 nm 到 >200 nm（图 1）。CCK-8 法测细胞活力。活力在 50-100 µg mL⁻¹ 间急剧下降，此后趋于平稳，高浓度下保持稳定（图 2）。

ROS 产生与黏蛋白释放

CM-H₂DCFDA 荧光定量 ROS 水平。增加 LSM 浓度未显著升高 ROS；250 µg mL⁻¹ 点偏差最大但统计不显著（图 3）。酶联凝集素测定（ELLA）测黏蛋白分泌，随 LSM 剂量递增逐渐下降，500 µg mL⁻¹ 降至对照组 ~40%（图 4）。

线粒体完整性与凋亡

JC-1 染色显示 ≥100 µg mL⁻¹ 浓度下线粒体去极化（图 5）。尽管如此，细胞色素 C 释放和 caspase-3 激活仅显示适度下降，指示凋亡诱导有限（图 6）。

结论

首次在气道上皮细胞评估 LSM 毒性显示可忽略的细胞毒性和凋亡，但显著抑制黏液分泌。尽管 ROS 生成和线粒体损伤微弱，黏液释放减少可能损害气道清除，未来在能源和生物医学领域应用时需谨慎评估。

材料与方法

气管原代细胞培养

按既定方案分离原代牛气管上皮细胞，在补充 EGF 1-53 和牛垂体提取物（BPE）的无血清培养基（SFM）中培养，贴壁于胶原包被板，37 °C、5% CO₂ 条件下维持。台盼蓝染色监测细胞密度。

细胞制备与活力测定

活力测定将细胞接种于胶原包被 96 孔板（5×10⁴ 细胞/孔），钙、ROS 和线粒体研究用 4 孔板（5×10⁵ 细胞/孔）。24 小时孵育后，更换 PBS，再换 LSM 悬液。CCK-8 测定（WST-8 转化为甲臜）量化活力，以未处理对照百分比表示。

镧锶锰氧化物纳米颗粒

LSM (La₀.₁₅Sr₀.₈₅MnO₃, 35 nm, 99.5%) 超声分散，测试浓度 500、250、100、50 µg mL⁻¹。浓度选择参考文献中典型 TiO₂ 纳米颗粒暴露水平。

扫描电子显微镜

颗粒滴铸于硅片，自然干燥，Zeiss Gemini SEM 成像确认尺寸分布。

活性氧检测

LSM 暴露 15 分钟后，CM-H₂DCFDA 荧光评估 ROS 产生，荧光强度与未处理对照比较。

线粒体损伤测量

JC-1 染料评估线粒体膜电位；荧光显微镜每 10 分钟测红/绿荧光比值。

黏蛋白分泌与 ELLA

LSM 暴露 15 分钟上清收集、离心，ELLA 检测黏蛋白，用 WGA-HRP 和 TMB 底物，450 nm 读吸光度。

凋亡标志物检测

RIPA 缓冲液制备细胞裂解液，ELISA 方案检测细胞色素 C 和活性 caspase-3。辣根过氧化物酶标记二抗辅助检测。

统计分析

数据呈至少三次独立实验的均值±SD。单因素 ANOVA 判定显著性（p<0.05）。

缩写

BPE

牛垂体提取物

ELISA

酶联免疫吸附测定

LSM

镧锶锰氧化物

ROS

活性氧

SFM

无血清培养基

SOFCs

固体氧化物燃料电池