使用带正电的磁性纳米粒子以超低浓度捕获细菌

背景

传染病是世界上最紧迫的健康挑战之一。水资源的微生物污染是对公众健康的主要威胁。 大肠杆菌 (大肠杆菌 )，一种革兰氏阴性细菌，在受污染的水和食物中很常见。 E 的一些菌株。大肠杆菌 甚至会引起严重的细菌感染。低浓度的细菌难以检测，通常需要在进一步分析之前进行预富集过程。基于培养的微生物方法很费力，可能需要几天时间。此外，一些细菌菌株可能会进入有活力但不可培养的状态，在这种状态下它们可以在常规琼脂上存活但不能培养，这阻碍了通过基于培养的方法对其进行检测 [1]。相反，细菌病原体的快速捕获和净化可以提供实时结果，以减轻传染病的爆发。

开发了多种材料以快速捕获和去除受污染源中的细菌。碳纳米管和树脂连接的低聚酰基赖氨酸珠已被用于去除水中的细菌 [2, 3]。磁性纳米粒子可以通过磁性过程方便地从各种资源中分离出来，被有机分子功能化后被广泛用于细菌检测和去污[4,5,6]。基于磁性的技术具有通过节省时间（通常分离时间在 1 h 内）、高回收率、可能的自动化和放大分离来捕获目标的优点 [7]。磁分离的效率和选择性很大程度上取决于配体，但有时很难获得对靶标具有高亲和力和特异性的配体。因此，有必要开发一种具有非配体依赖性磁性纳米颗粒的细菌捕获系统来捕获细菌，尤其是在低浓度下。

许多科学家已经研究了细菌电荷的性质。 Bechhold (1904) 是第一个发现细菌细胞带有负电荷这一事实的人 [8]。虽然已经知道大量细菌细胞倾向于保持负电荷，但在单细胞水平上对细菌的电生理学知之甚少。 2011 年，科恩等人。在 E 中发现电尖峰。大肠杆菌 在高达 1 Hz 的频率下使用荧光电压指示蛋白 [9]。由于多种细菌细胞壁带负电荷，带正电荷的纳米粒子可以通过静电相互作用与广谱细菌发生强烈相互作用。

为了利用磁性纳米粒子和单个细菌的负电荷进行快速病原体检测，我们设计了一个系统来捕获低浓度细菌。带正电荷的磁性纳米粒子由聚乙烯亚胺（PEI）制成，其由丰富的胺基组成。然后我们研究了 PEI 功能化纳米粒子对 E 的亲和力。大肠杆菌 .这种创新方法通过静电相互作用提供了与细菌的有效结合。

材料和方法

纳米材料

氯化铁（III）水合物（FeCl3·6H2O）、氢氧化铵（NH4OH，28 wt%）、盐酸（37 wt%水溶液）、乙二醇、醋酸钠购自上海（中国）试剂公司。原硅酸四乙酯 (TEOS)、（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷 (APTES) 和荧光素四甲基罗丹明 (TRITC) 购自 Sigma-Aldrich（美国）。支化聚（乙烯亚胺）（PEI，99%，Mw =10,000) 购自 Alfa Aesar。所有溶液均使用 Milli-Q 去离子水（18.2 MΩ cm，25 °C 电阻率）制备。

NP 综合

Fe3O4 纳米粒子是通过溶剂热反应制备的 [10]。简而言之，在磁力搅拌下，将 0.081 g FeCl3·6H2O 溶解在 30 mL 乙二醇中。然后，将 0.3 g 聚丙烯酸 (PAA) 和 1.8 g 尿素添加到该溶液中。搅拌30 分钟后，使用衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜将溶液在200 °C加热12 小时。当冷却至室温时，磁铁收集黑色产物，即磁性纳米粒子核。用乙醇和去离子水各洗涤 3 次，Fe3O4 纳米颗粒用 0.15 M HCl 超声处理 15 min，然后通过水解和 TEOS 包覆二氧化硅。

为了制备带负电荷的荧光磁性纳米粒子 (NP-)，APTES-TRITC (C33H44N3O6Si) 复合物首先在黑暗条件下在乙醇中反应过夜。然后通过 APTES 与 Fe3O4@SiO2 纳米颗粒上的羟基反应，将复合物接枝到 Fe3O4 纳米颗粒上。随后，加入30 μL TEOS并在黑暗中反应24 h。随后用乙醇和去离子水各洗涤 3 次，产生荧光 NP−。通过用聚阳离子聚合物PEI对NP-进行修饰，完成了带正电荷的磁性纳米粒子(NP+)。

NP 表征

透射电子显微镜 (TEM) 研究由 TECNAI F ^{− 30} 进行 高分辨率透射电子显微镜，工作电压为 300 kV。纳米颗粒的粒径和 zeta 电位由 Malvern Zeta Sizer Nano 系列（马萨诸塞州韦斯特伯勒）测定。用卡尔蔡司LSM5 EXITER激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss，Jena，Germany）检查荧光。

细菌准备

革兰氏阴性菌株E。大肠杆菌 BL21用作模型细菌。 E。大肠杆菌 在 100 mL Luria Broth 培养基中培养 [11]。将细菌在恒温培养箱中以200 rpm、37 ℃培养16 小时。随后，取出100 μL的细菌培养物，用培养基稀释1 × 10 ⁵ 次，涂在琼脂上，37 ℃培养24 h。计数菌落形成单位的数目。通过在 5000 rpm 下离心 5 分钟收集剩余的细菌细胞，用 1× PBS（10 mM，pH 7.4）洗涤三次，并稀释至浓度约为 1 × 10 ³ 菌落形成单位 (CFU)/mL。出于安全考虑，所有细菌样本均置于121 °C高压灭菌器中20 min处理后进行杀菌处理，所有接触细菌的玻璃器皿使用前后均进行灭菌处理。

细菌捕获实验

所有批次捕获研究均在灭菌的 1x PBS 缓冲液中进行。将 40 微升 NPs（1 μg/μL）分散在灭菌盐水中，超声处理 10 分钟，然后将 1 mL 细菌溶液（约 10 ³ CFU/mL) 加入悬浮液中。孵育 10 min 后，NP 结合的细菌通过永磁体捕获到小瓶壁上，并用洗涤液去除游离细菌。通过去除磁铁释放捕获的细菌并重新悬浮在 PBS 中。对于显微分析，将等分的细菌涂在载玻片上并用 Hema-3 (Fisher Diagnostics) 染色。对于免疫荧光分析，将等分的细菌涂在载玻片上并用 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色。

不同浓度 NPs 的细菌捕获效率

一毫升菌悬液（约2 × 10 ² CFU/mL) 与不同量（5、10、20、30、40、50、75 和 100 μg/mL）的 NP+ 或 NP- 孵育 10 分钟。通过纳米颗粒进行磁性分离后，对总溶液进行取样并通过平板计数法分析细菌浓度。通过计算LB琼脂平板上的CFU数来测试NPs的细菌捕获效率。

纳米颗粒在低浓度下捕获细菌的能力

将 40 微克 NP+ 或 NP- 与 1 mL 的极低浓度（10 和 10 ² CFU/毫升）。通过纳米颗粒进行磁性分离后，对总溶液进行取样并通过平板计数法分析细菌浓度。通过计算LB琼脂平板上的CFU数来测试NPs的细菌捕获效率。

统计分析

结果表示为平均值 ± 标准偏差（SD），如图例所示。使用带有 P 的 GraphPad Prism 软件计算具有适当 hoc 分析的双向方差分析 (ANOVA) 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

磁性纳米颗粒的表征

表面带电磁性复合纳米粒子的制备示意图如图 1 所示。Fe3O4 纳米粒子与 APTES 共轭，与 TEOS 和 NH4OH 反应后，在纳米粒子表面形成一层薄薄的 SiO2 壳层。为了直接对捕获的细胞进行可视化和量化，APTES-TRITC 复合物首先发生反应，然后通过经典的溶胶-凝胶反应接枝到 Fe3O4@silica 复合材料的表面。丰富的SiOH 基团控制着该产品的整个表面，表现出强烈的负表面电荷，即带负电荷的磁性纳米粒子（NP-）。对于带正电荷的磁性纳米粒子 (NP+)，PEI 分子用于覆盖和修饰 NP- 的表面。由于大量胺基团的存在，改性产物显示出很强的表面正电荷。

纳米粒子的设计。表面带电荧光超顺磁性复合纳米粒子（NPs）的设计示意图

如图 2a 所示，TEM 表明磁性复合纳米粒子的直径为 450 nm，由均匀的 SiO2 涂层（尺寸为 60 nm）组成。图 2b 中颗粒的动态光散射 (DLS) 显示出窄尺寸分布，表面功能化后平均直径增加。带正负电荷的复合纳米粒子的最大尺寸分别为620和700 nm。 DLS 测量的纳米颗粒通常比 TEM 测量的要大。这是因为 DLS 评估的尺寸受布朗运动的影响，并取决于环境温度、纳米粒子的动态半径以及静态环境通过发生冲突而触发的纳米粒子团聚程度 [12]。图 2c 显示了负和正纳米粒子的 zeta 电位分布。在去离子水（pH 7.0）中，NP-和NP+的zeta电位分别为- 26.6 mV和+ 28.1 mV。 NP+ 的 zeta 电位的 pH 依赖性在附加文件 1：图 S1 中描述。这些结果表明，在中性条件下，表面带电的纳米粒子在水溶液中分散良好，可用于细胞捕获。

纳米颗粒的表征。 一 带正电的纳米颗粒 (NP+) 和带负电的纳米颗粒 (NP-) 的透射电子显微镜 (TEM) 图像。 b 纳米颗粒的动态光散射大小和分布。 c NPs的Zeta电位分布

磁性 NP 捕获 E.大肠杆菌

图 3 显示了细菌捕获的一般实验程序。将纳米颗粒与细菌溶液混合并在室温下孵育 10 分钟。随后，我们使用永磁体将“磁化”细菌（结合到细胞表面的磁性纳米粒子）捕获到管壁上。在去除剩余的溶液并用 PBS（外面有磁铁）清洗聚集体后，我们将聚集体转移到载玻片上进行显微分析。如该方案所示，NP+ 提供足够的静电响应以快速富集E。大肠杆菌 .反之，NP−实验则用PBS漂洗去除细菌。

细菌捕获程序的插图。 E。大肠杆菌 悬浮液分别与NP+和NP-混合，然后孵育10 分钟。 “磁化”细菌被磁铁吸引到小瓶壁上。去除剩余溶液后，用NPs捕获细菌，用PBS洗涤，从菌落数开始计数

纳米粒子的光学图像如图 4 所示。NP- 的光学图像显示了单分散和均匀分布的粒子。然而，NP+趋向于团聚。 NP+的尺寸分布明显宽于NP-。这些结果表明NP+和NP-与E具有完全不同的相互作用模式。大肠杆菌 .为了进一步研究 NP+ 的细菌亲和力，在 E 中定位 NP+。大肠杆菌 使用荧光分析进行检查。图 5a 显示捕获的 E。大肠杆菌 DAPI（蓝色）和 TRITC（红色）均为阳性。为了清楚地确认NP+对细菌的亲和力，使用了TEM技术。在图 5b 中，观察到许多 NP+ 聚集在细菌细胞壁上。这些结果表明NP+对细菌有很强的亲和力。

E 的比较。大肠杆菌 NP+ 和 NP- 的结合能力。左图是细菌与 NP+ 结合的相衬场。正确的图像只有纳米粒子，表明 NP- 对 E 没有结合能力。大肠杆菌 细胞

E 的荧光和 TEM 图像。大肠杆菌 与 NP+ 结合。 一 上图显示了E 的荧光图像。大肠杆菌 与 NP+ 结合的细胞。 DAPI 用于染色细胞核。 TRITC 被标记在 NPs 中。 b 下图是显示 NP+ 和 E 的代表性 TEM 图像。大肠杆菌 复合体

检测E 的低浓度。大肠杆菌

为了进一步表征细菌和 NP+ 相互作用的动力学，我们培养了 E。大肠杆菌 在一个常数 (2 × 10 ² CFU/mL)，各种 NPs 浓度范围从 5 到 100 μg/mL。然后磁性捕获并分离NP结合的细菌。 NP+ 和 NP- 对细菌的磁性捕获效率绘制如图 6 所示。E 的数量。大肠杆菌 即使在 100 μg/mL 的高浓度下，NP− 捕获的浓度也仅为 12%。与 NP− 相比，NP+ 显示出显着的细菌捕获能力，并且在 40 μg/mL (P <0.001)。从LB琼脂平板上可以看出，NP+的菌落数量呈剂量依赖性增加。

E 的捕获效率。大肠杆菌 通过 NP+ 或 NP- 指示的各种浓度。左图是涂有 E 的 LB 琼脂平板的照片。大肠杆菌 被 NP+ 和 NP- 捕获。右图显示了不同浓度下 NP 的细菌捕获效率。 E。大肠杆菌 (2 × 10 ² 没有NP孵育的1 mL PBS溶液中的CFU被计为100%并用作对照。 *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001

为了确认 NP+ 对 E 的亲和力。大肠杆菌 在超低浓度下，我们将 40 μg NP 与仅包含 10 和 100 CFU 的 E 的 1 ml PBS 溶液混合。大肠杆菌 .图 7 显示了所有样品在琼脂平板中所得菌落的照片。正如预期的那样，NP+ 确实捕获了 E。大肠杆菌 在超低浓度下，而使用 NP− 的平板中细菌菌落不明显。平板中的少数菌落可能归因于纳米颗粒的非特异性亲和力。进一步的分析表明，使用 NP+ 在超低浓度（10 和 100 CFU/mL）下获得了超过 90% 的细菌捕获效率。相比之下，在相同条件下，NP−的捕获效率小于4%，具有显着差异（P <0.001)。这些结果表明 NP+ 对细菌有很强的亲和力，这可以用静电吸引力来解释。为了研究广谱细菌捕获特性，我们采用了三种革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌 , 金黄色葡萄球菌 和乳酸乳球菌 ) 作为模型。如附加文件 1：图 S2 中所示，NP+ 对杆菌（大肠杆菌 和 B.枯草 ) 而不是葡萄球菌 (S. aureus ) 和链球菌 (L. lactis ）。此外，我们还发现带负电荷的分子，如 3-溴丙酮酸 (3-BP) 和 DNA，可能会干扰细菌的捕获效果。死的大肠杆菌 对此类系统无效（附加文件 1：图 S3）。

E 的捕获效率。大肠杆菌 通过 NP+ 或 NP- 在超低浓度。左图是涂有 E 的 LB 琼脂平板的照片。大肠杆菌 被 NP+ 和 NP- 捕获。右图显示了 E。大肠杆菌 用超低浓度细菌捕获 NPs (40 μg/mL) 的效率。 E。大肠杆菌 （在 1 mL PBS 溶液中的 10 和 100 CFU）没有 NP 孵育被计为 100% 并用作对照。 ***P <0.001

讨论

众所周知，革兰氏阴性菌（例如 E.coli ）和革兰氏阳性菌（如枯草芽孢杆菌 ) 比带负电的粒子更容易通过静电吸引与带正电的粒子相互作用 [13, 14]。在我们的研究中也发现了这一点。我们的捕获系统的一个优势是 PEI 功能化的纳米粒子具有更多的胺基团，能够以超低浓度捕获细菌。迄今为止，有一些通用且令人满意的检测方法可以检测浓度低于 10 ² 的细菌。 CFU/mL，无需通过培养过程预富集细菌。该研究展示了一种简单的分析方法，该分析使用电磁纳米粒子在 1 小时内以 10 CFU/mL 的浓度捕获和检测革兰氏阴性细菌（生物体具有细胞质膜、细胞壁和完整的外膜）。

在我们的实验中，我们发现 NPs 的表面电荷会影响细菌捕获效率。在这里，使用 E.coli 研究了 NPs 表面的电荷对细菌捕获效率的影响 作为模型细菌。当 NP+ 用于捕获测定时，它们表现出有效的细菌吸附能力。细菌捕获效率随着NP+剂量的增加而增加。 TEM 显微镜显示由纳米颗粒和细菌细胞组成的宏观聚集体。相比之下，NP-，即使在高浓度下，也表现出低细菌捕获能力。总体而言，这些观察表明NP+具有明显高于NP-的捕获能力。

尽管革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的膜结构存在差异，但大多数在生理 pH 值下培养时都带有负电荷 [15, 16]。细菌细胞的细胞表面电荷已通过静电相互作用色谱 (ESIC) [17] 进行表征。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由一层厚厚的肽聚糖构成，肽聚糖内嵌磷壁酸。另一方面，革兰氏阴性菌的外表面有一层脂多糖，然后是一层薄薄的肽聚糖。磷壁酸和脂多糖使细菌细胞表面带负电荷 [18]。以前，带正电荷的银纳米粒子 (AgNPs) 显示出对微生物的显着功效，包括E。大肠杆菌 [19]。他们发现，发现较小的颗粒具有更大的抗菌活性。我们认为较大的颗粒可能具有不同的细菌吸收性益处。首先，较大的颗粒难以到达细胞的核内，从而对细菌产生毒性。其次，它们可以提供更大的表面积，因此可以提供更强的细菌相互作用。因此，我们设计并应用了更大的带正电荷的纳米粒子作为“海绵”剂来捕获细菌。

结论

总之，通过 PEI 磁性纳米粒子，我们展示了一种简单快速的检测方法，可以让 E.大肠杆菌 被捕获和分析。现有的细菌光学和 TEM 档案档案可以轻松识别捕获的细菌。带正电荷的磁性纳米粒子提供的高回收率将允许在超低浓度下检测其他细菌菌株。

缩写

APTES：

3-氨基丙基三乙氧基硅烷

CFU：

菌落形成单位

DLS：

动态光散射

E.大肠杆菌 ：

大肠杆菌

NP：

带负电荷的磁性纳米粒子

NP+：

带正电荷的磁性纳米粒子

NP：

纳米粒子

PAA：

聚丙烯酸

PEI：

聚乙烯亚胺

标准差：

标准差

TEM：

透射电子显微镜

TEOS：

原硅酸四乙酯

TRITC：

四甲基罗丹明