功能化叶酸修饰氧化石墨烯/PEI siRNA 纳米复合物用于靶向卵巢癌基因治疗

介绍

卵巢癌是世界上主要的妇科死亡原因，由于早期诊断和治疗困难，通常与较差的临床结果有关 [1,2,3]。不幸的是，传统的化疗药物表现出固有的局限性，例如非特异性分布、生物利用度差、血液清除快以及在生理环境中的溶解度差 [4]。在过去的几十年中，基因疗法已被研究作为治疗各种遗传疾病（包括癌症）的潜在方法 [5,6,7,8]。然而，缺乏安全、高效和选择性的基因递送载体阻碍了其向临床应用的发展。目前，有两类基因载体：病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体已显示出高转染效率，但一些缺点限制了它们的临床应用，例如严重的免疫炎症反应和与野生型病毒重组的风险 [9, 10]。相比之下，非病毒载体具有广泛的递送能力、低免疫原性和结构灵活性，使其成为病毒载体的绝佳替代品 [11,12,13]。随着纳米技术的快速发展，许多纳米粒子已被探索作为基因传递载体的潜在用途[14, 15]。在这里，这项工作设计了一种新型的非病毒载体PEG-GO-PEI-FA，可以有效地递送至肿瘤组织。

氧化石墨烯 (GO) 是石墨的衍生物，通过对石墨进行多步氧化、超声和纯化 [16]。 GO 表面含有环氧基、羟基和羧基[17]。其表面的氧官能团赋予 GO 优异的生物相容性，使其能够在水和有机溶剂中形成稳定的悬浮液，促进化学修饰和功能化 [18, 19]。因此，GO 已广泛用于光热癌症治疗、药物和基因传递以及生物传感器 [20,21,22]。聚乙二醇 (PEG) 是一种安全、无毒、可生物降解的材料；它已被美国食品和药物管理局批准为亲水性药物载体 [23]。用PEG对GO进行功能化可以提高生理条件下的稳定性，延长GO纳米材料在体内的循环时间，改善GO纳米材料的药代动力学，更好地靶向肿瘤[24, 25]。聚乙烯亚胺 (PEI) 因其在各种细胞系中的高转染效率而成为非病毒载体的黄金标准 [26]。然而，PEI显示出严重的细胞毒性和较差的生物相容性，从而限制了其临床应用。在这项研究中，我们观察到当 PEI 接枝到 GO 表面时细胞毒性显着降低。叶酸受体在各种癌细胞表面过度表达，尤其是在化疗前后的卵巢癌细胞中 [27]。对于靶向基因递送，叶酸分子与GO共价结合以靶向叶酸受体。

总体而言，本研究的主要目的是探索一种新的基于 GO 的靶向基因递送系统，以提高基于 siRNA 的基因治疗对卵巢癌的效用。获得的带正电荷的 PEG-GO-PEI-FA 可以加载 siRNA 进行基因传递。使用各种技术对其成功合成、表征、有效细胞内化和体外抗癌作用进行了分析。此外，还对该系统的安全性进行了体外评价。

材料和方法

材料

氧化石墨烯购自苏州碳丰石墨烯科技有限公司（中国苏州）。叶酸 (FA)，N -羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 和异硫氰酸荧光素 (FITC) 购自 Sigma Aldrich Trading Co. Ltd.（中国上海）。支链 PEI 25K、PEG (MW =2000)、琼脂糖和 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC·HCL) 购自安道麦试剂有限公司（中国上海）。磷酸盐缓冲液 (PBS)、Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS) 和所有其他化学品均购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。所有其他化学品均为试剂级。 RPMI-1640 培养基 (Gibco)、胎牛血清 (FBS) (Gibco)、胰蛋白酶 (Gibco) 和 20 × TAE 缓冲液购自 Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China)。细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自上海益生生物有限公司（中国上海）。 LysoTrackerRed、4% 多聚甲醛、4'-6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 和 Lipofectamine 2000 转染试剂购自 Invitrogen Co. Ltd.（中国）。 Dil荧光探针（货号：C1036）购自Beyotime Co. Ltd. Anti-PLK1（PLK1-homo-581）短干扰RNA（siRNA）由上海基因制药有限公司（中国上海）合成。

制备PEG-GO-PEI-FA

PEG-GO-PEI-FA 的合成是根据图 S2 (A) 中所示的策略进行的。首先，将 10 mL GO 水悬浮液 (1000 μg/mL) 在 50 W 下连续超声浴 2 h。然后，加入 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) 和 NHC (5000 μg/mL) 并在 100 W 下间歇超声处理 30 分钟，然后加入超声处理 30 分钟的 PEG (10 mg) 并在磁力搅拌下搅拌在 0 °C 下搅拌 6 小时。为了去除未反应的试剂并得到GO-PEG溶液，将混合物在带有透析膜（MWCO，3500 Da）的蒸馏水中透析24 小时。然后，GO-PEG 溶液超声处理 30 min，加入 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) 和 NHC (5000 μg/mL)，再次超声处理 30 min，然后加入 PEI 25K (5000 μg/mL) ) 2 mL。将混合物超声处理 30 分钟并在 0 °C 下搅拌 6 小时。随后，为了得到PEG-GO-PEI，再次用透析膜(MWCO，3500 Da)将混合物在蒸馏水中透析24 小时。将 PEG-GO-PEI 溶液超声处理 60 分钟，加入 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) 和 NHC (5000 μg/mL) 并再次超声处理 30 分钟，然后向溶液中加入 10 mg FA .根据上述程序将溶液超声处理30 min并在0 ℃下搅拌12 h，透析48 h得到PEG-GO-PEI-FA。纳米复合物溶液经真空冷冻干燥机（Biosafer-10D）干燥。

特征化

通过动态光散射 (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK) 测量水溶液中纳米复合物的表面 zeta 电位和平均粒径。在大气中使用原子力显微镜（AFM，MuLtimode Nanoscope IIIa，Germany）观察纳米复合物的形态。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 光谱由 Thermo Nicolet 6700 FTIR 光谱仪获得，使用 KBr 颗粒在 400–4000 cm ^-1 范围内 .通过紫外-可见分光光度计（UV，EV300，美国）测量纳米复合物的紫外-可见吸收光谱。纳米复合物的拉曼光谱采用色散拉曼显微镜（Senterra R200-L，德国），激发波长为532 nm。

体外生物安全检测

SKOV3（人卵巢癌细胞）购自 Keygen（中国）。将细胞维持在 RPMI-1640 培养基中，并补充有 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 g/mL 链霉素，并在 37 °C 和含有 5% CO2 的湿润气氛中培养。在这项研究中，材料的细胞毒性在 SKOV3 细胞中通过 CCK-8 分析进行了分析。简而言之，将细胞以6×10 ³ 的密度接种于96孔板中。 细胞/孔，在含有 10% FBS 的 100 μL 1640 培养基中，然后在 37 °C 下在含有 5% CO2 的湿润气氛中孵育 12 小时。然后，GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI 和 PEG-GO-PEI-FA 以 10 至 1000 μg/mL 的最终浓度加入，并与细胞一起孵育另外 12 小时。另外，GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI和PEG-GO-PEI-FA在100 μg/mL的浓度下孵育4至24 小时的不同时间。随后，每孔加入10 μL的CCK-8，并在37 °C下再孵育3 小时。之后，在酶标仪上测量 450 nm 处的吸光度。每组实验重复3次。与在培养基中培养的对照细胞相关的相对细胞活力（%）计算为（样品吸光度-空白吸光度）/（对照吸光度-空白吸光度）×100%。

琼脂糖凝胶延迟测定

用 DEPC 处理过的水稀释 20×TAE 缓冲液，制成 1% 的琼脂糖溶液。然后，将溶液用微波炉加热 5 min，使琼脂糖完全溶解。当琼脂糖溶液的温度降至55 ℃时，加入体积比为10,000:1的溴化乙锭（EB，0.5 μg/mL）溶液并混合均匀，随后将琼脂糖溶液冷却形成琼脂糖凝胶.将不同重量比的 PEG-GO-PEI、PEG-GO-PEI-FA 和 siRNA 混合物添加到孔中。凝胶在110 V和40 mA下运行约60 min，然后用紫外成像仪观察和分析。

PEG-GO-PEI-FA 的细胞摄取研究

为了研究细胞摄取，根据先前描述的方法用 FITC 标记纳米复合物，并稍作修改 [28]。简而言之，将纳米复合物溶液（约 1 mg/mL，2.0 mL）与溶解在 DMSO 中的 0.2 mL FITC（26 mM）混合，然后在室温下搅拌过夜。将所得混合物通过 5000 MWCO 膜透析以除去未标记的 FITC，然后冻干。将细胞以 2 × 10 ⁵ 的密度接种于 6 孔板（含盖玻片）中 细胞/孔在含有 10% FBS 的 2 mL 1640 培养基中，然后在细胞培养箱中在 37 °C 下培养 12 小时。然后，将每孔中的培养基更换为无血清1640培养基。随后，用不同的纳米复合物/FITC 处理细胞。未经纳米复合物处理的细胞为对照组，经PEI 25 K处理的细胞为平行对照组。 37 °C、5% CO2加湿培养4 h后，除去培养板液体，用冷DPBS（pH=7.4）洗涤细胞两次，然后用20 μL DAPI和5 μL Dil（将细胞膜染料）加入每个孔中，并在 37 °C 下避光孵育 20 分钟。随后，去除培养基中的 DAPI 和 Dil，用冷 DPBS (pH =7.4) 洗涤两次，取出细胞盖玻片并用 Permount TM Mounting Medium 固定在载玻片上。随后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞载玻片的荧光信号，分析纳米复合物的细胞摄取情况。

内质体逃逸和渗透到细胞核中

为了观察细胞分布、内体逃逸和纳米复合物的渗透，将 SKOV3 细胞以 1 × 10 ⁵ 的密度接种在 12 孔板（包含盖玻片）中 细胞/孔在含有 10% FBS 的 2 mL 1640 培养基中，然后孵育 12 小时（37 °C，5% CO2）。然后，将每孔中的培养基更换为1 mL/孔的无血清1640培养基。随后，将FITC标记的不同纳米复合物（100 μg/mL）以1 mL/孔加入12孔板中。 6 h后，除去液体，用冷DPBS（pH =7.4）洗涤细胞两次，12孔板加入LysoTracker Red（5 μg/mL）50 μL/孔。 37 °C、5% CO2加湿培养15 分钟后，除去12孔板的液体，用冷DPBS（pH=7.4）洗涤细胞两次，然后加入20 μL DAPI加到每个孔中，并在 4 °C 下避光孵育 20 分钟。接下来，取出 DAPI 液体并用冷 DPBS (PH =7.4) 洗涤两次。之后，用4%多聚甲醛室温固定15 min，取出盖玻片，用Permount TM Mounting Medium固定在载玻片上。共聚焦激光扫描显微镜观察载玻片的荧光信号，分析溶酶体逃逸和渗入纳米复合物细胞核的情况[29]。

细胞抑制分析

我们使用 CCK-8 测定分析了 PEG-GO-PEI/siRNA 和 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 的细胞抑制作用。很快，将细胞以6×10 ³ 的密度接种于96孔板中 细胞/孔，在含有 10% FBS 的 100 μL 1640 培养基中，然后在 37 °C 下在含有 5% CO2 的湿润气氛中孵育 12 小时。然后，以 10 至 500 μg/mL 的终浓度加入 PEG-GO-PEI 和 PEG-GO-PEI-FA，并与细胞再孵育 12 和 24 小时。然后，将PEG-GO-PEI/siRNA和PEG-GO-PEI-FA/siRNA与细胞以100 μg/mL的浓度孵育4至48小时。 siRNA转染Lipofectamine 2000，未处理作为对照组。随后，每孔加入10 μL的CCK-8，并在37 °C下再孵育3 小时。在450 nm处测量吸光度。每组实验重复3次。抑制率（%）的计算公式为1-（样品吸光度-空白吸光度）/（对照吸光度-空白吸光度）×100%。

统计数据

每个实验测试重复3次，数据采用SPSS 17.0软件进行分析。用于多组分析和未配对学生 t 的单向方差分析 比较采用两组分析检验。数据以均值和标准差（SD）表示，统计学显着性设为p <0.05.

结果与讨论

PEG-GO-PEI-FA的合成

首先基于Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute.org/ccle)数据库[30]和基于Gene Expression Profiling Interactive的卵巢不同组织分析了FR在不同癌细胞系中的表达分析（GEPIA2；http://gepia2.cancer-pku.cn）数据库[​​31]。结果与先前的研究一致（图S1）。因此，我们选择FA作为基因递送的靶向配体。

氧化石墨烯肯定带有许多含氧基团，包括边缘的羧基、羟基和氧化过程产生的基面上的环氧基团 [32]。为了获得纳米级 GO (NGO)，GO 通过在 50 W 下超声浴连续裂解 2 h，然后使用 EDC/NHS 化学将 PEG/PEI/FA 共价连接到 GO，如图 S2（A）所示。图S2(B)显示了PEG-GO-PEI-FA/siRNA的处理途径。通过FTIR差分光谱技术进行化学共轭分析以获得光谱吸收峰[33]。如图 1a 所示，OH (3425 cm ^-1 ), C=O (1719 cm ⁻¹ ), 并且 C=H (1350 cm ⁻¹ ) 在 GO 中发现了官能团，表明 GO 表面存在羟基和羧基。 CH (2885 cm ⁻¹ ) 当 PEG 通过稳定的共价键与 GO 反应时，可以发现伸缩振动带；这表明PEG已经接枝到GO上，PEG结合效率约为6%。 PEI 和 FA 与 GO 反应后，NH (1590 cm ⁻¹ ), C–N (1420 cm ⁻¹ ) 观察到伸缩振动带，表明 PEI 和 FA 已通过酯化接枝到 GO。这些结果表明共轭PEG-GO-PEI-FA已成功合成。

使用傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 和紫外-可见分光光度计成功分析了 PEG-GO-PEI-FA。 一 GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI 和 PEG-GO-PEI-FA 的 FTIR 光谱。 b GO、FA、GO-PEG、PEG-GO-PEI和PEG-GO-PEI-FA的UV-Vis吸收光谱

图 1b 显示了 GO、FA、GO-PEG、PEG-GO-PEI 和 PEG-GO-PEI-FA 的 UV-Vis 吸收光谱。 GO 的吸收峰为 223 nm。 FA 的吸收峰为 275 nm。 GO-PEG 呈现平滑曲线，说明 PEG 与 GO 结合，使 GO 的山峰更加平滑。 PEG-GO-PEI 在 219 nm 处有一个吸收峰，说明 PEI 已经接枝到了 GO-PEG 的表面。 PEG-GO-PEI-FA在219 nm和275 nm处有吸收峰，表明FA接枝到PEG-GO-PEI上。这些结果进一步证明了PEG-GO-PEI-FA的合成成功。

PEG-GO-PEI-FA 的表征

表 1 中给出的数据显示了纳米复合物的粒径和 zeta 电位。纳米复合物的粒径逐渐增加到 218.4 nm，而 PEG、PEI 和 FA 逐渐接枝到 GO 表面。当 PEI 连接到 GO 时，zeta 电位从 - 16.5 变为 + 17.5 mv，这促进了通过静电相互作用和细胞摄取吸附带负电荷的 DNA 或 RNA 的能力。 PEG-GO-PEI-FA 和 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 的 zeta 电位分别为 + 14.7 mv 和 + 14.5 mv。 zeta 电位表明 PEG-GO-PEI-FA 或 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 比 PEG-GO-PEI 小，因为 FA 和 siRNA 带负电荷。这表明PEG-GO-PEI-FA/siRNA可以通过电荷相互作用吸附到细胞表面，并被受体介导的细胞膜内吞作用利用[34]。

纳米载体的表面形态和粒径也通过 AFM 和 DLS 测量。如图 2a 所示，GO 显示出光滑的表面和片状结构，粒径为 192.1 nm。 PEG、PEI和FA接枝到GO表面后，PEG-GO-PEI-FA的粒径增加到216.1 nm，在PEG-GO-PEI-FA表面观察到许多突起（图2b） )，表明大量的装饰物被固定在 GO 片上。同时，PEG-GO-PEI-FA的高度大于GO，这主要是由于PEG、PEI和FA都附着在GO片的两个平面上。

纳米级传递系统的表征。原子力显微镜 (AFM) 和动态光散射 (DLS) 用于表征形态和尺寸分布：a GO 和 b PEG-GO-PEI-FA。用于分析生成的氧化石墨烯表面的 GO、GO-PEG 和 PEG-GO-PEI c 的拉曼光谱

拉曼光谱是最常用于测量纳米碳材料的表征和结构特性的方法之一[35]。如图2c所示，GO的拉曼光谱显示在1600 cm ^-1 处的振动带 (G 波段) 和 1354 cm ⁻¹ (D带),ID/IG的面积比为1.0385,说明SP ² GO 的杂交被破坏并形成羟基和羧基。 GO-PEG 和 PEG-GO-PEI 在 1595 cm ^-1 处显示振动带 (G 波段) 和 1352 cm ⁻¹ (D带)，ID/IG的面积比分别为0.7737和0.5238。随着PEG和PEI与GO反应，ID/IG的面积比逐渐降低；这表明PEG和PEI已经接枝到GO的表面。

不同职能 NGO 的体外生物安全分析

非病毒基因载体的生物安全问题一直是临床应用的重大挑战。高正电荷不仅带来了极好的凝聚和保护基因的能力，而且导致了严重的细胞毒性 [36, 37]。为了测试游离 siRNA 纳米复合物的细胞毒性，CCK-8 测定是用 SKOV3 细胞进行的，这些细胞已经与不同浓度（从 10 到 1000 μg/mL）的游离纳米复合物一起孵育 4、8、12 和 24 小时。如图 S3 所示，纳米复合物在 1000 μg/mL 和 24 h 时在卵巢癌中仍然具有高细胞活力。所有纳米复合物的细胞毒性均表现出时间和浓度依赖性方式（SKOV3细胞的活力：1000 μg/mL时所有纳米复合物大于或等于84.38%，24 h时所有纳米复合物大于或等于94.21% SKOV3 细胞）。这些结果表明纳米复合物的细胞毒性可以忽略不计，可以作为生物相容性基因载体。

纳米复合物结合siRNA的分析

由于游离 RNA 分子带有大量负电荷，细胞对游离 RNA 分子的摄取通常很棘手 [38]。通过阳离子聚合物负载带负电荷的生物分子被广泛采用来解决这个问题[39]。在本文中，通过在水溶液中混合 siRNA 和 PEG-GO-PEI-FA 来实现 siRNA 在 PEG-GO-PEI-FA 载体上的负载。如表1所示，PEG-GO-PEI-FA的zeta电位为+14.7 mV，表明siRNA可以通过静电相互作用吸附到PEG-GO-PEI-FA的表面。在这项研究中，纳米复合物的基因凝聚能力通过琼脂糖凝胶电泳进行评估 [40]。图3a显示PEG-GO-PEI在重量比为10时对siRNA具有明显的缩合能力，而当重量比达到20时观察到PEG-GO-PEI-FA完全阻滞siRNA迁移（图3b）。因此，PEG-GO-PEI-FA 可以保护 siRNA 免于降解，但同时需要更多的纳米复合物来表现出良好的结合能力。这可能与 PEG-GO-PEI-FA 的 zeta 电位不那么高有关。这些结果表明 PEG-GO-PEI 和 PEG-GO-PEI-FA 具有足够的递送能力，尤其是 PEG-GO-PEI-FA，进一步展示了其作为有效和安全递送基因的有效载体的潜力。

不同重量比下的 siRNA 负载能力。进行琼脂糖凝胶阻滞试验以评估 siRNA 和纳米载体之间的相互作用。 一 PEG-GO-PEI 和 b 不同重量比的PEG-GO-PEI-FA（材料/siRNA）

细胞摄取分析

如果载体可以专门针对肿瘤进行基因传递，这一点至关重要。为了确认 PEG-GO-PEI-FA 载体是否可以轻易进入细胞，我们使用 FITC 作为荧光探针进行细胞内成像。同时，细胞核用DAPI染色，细胞膜用Dil染色。如图4所示，对照组和PEG-GO-PEI组在细胞核和细胞膜周围没有显示绿色荧光信号。这意味着 PEG-GO-PEI 没有进入细胞。 PEI 25K 和 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 在核心周围表现为绿色荧光信号，这清楚地表明 PEG-GO-PEI-FA 可以穿透细胞膜进入细胞。 PEG-GO-PEI-FA 纳米复合物显示出最活跃的细胞摄取，这可能归因于 FA 可以特异性结合在 SKOV3 细胞表面过表达的 FR。这些结果表明 FA 在介导 PEG-GO-PEI-FA 和 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 纳米复合物的有效细胞摄取方面发挥了关键作用。更重要的是，FA与其受体结合的能力不受共价酰胺键的影响，受体介导的内吞作用不受阻碍。

不同纳米复合物的细胞摄取。孵育 4 小时后，人卵巢癌 SKOV3 细胞中 FITC 标记的不同纳米复合物的细胞摄取的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 图像。蓝色，细胞核（DAPI 标记）；红色，细胞膜（Dil 标记）；绿色，纳米复合物（FITC 标记）。比例尺代表100 μm，但在单格中比例尺为10 μm

溶酶体逃逸分析

对于 siRNA 传递系统，它们应该从内体或形成的溶酶体中逃脱。然而，如果没有，siRNA 会降解或排出细胞 [41,42,43]。我们使用 CLSM 通过纳米复合物的细胞内定位来评估内体逃逸能力。由于许多报道表明 PEI 25K 可以通过“质子海绵效应”[44] 有利于内体或溶酶体逃逸，因此使用 PEI 25K 作为对照。在这项研究中，纳米复合物用 FITC 标记。首先，我们通过FITC的绿色荧光信号与Lyto Tracker Red的红色荧光信号重叠的黄色信号估计纳米复合物进入溶酶体。 PEI 25K 与细胞孵育 4 h 后出现黄色信号，其他材料与细胞孵育 2 h 后出现黄色信号，表明材料已进入细胞（图 5）。无论纳米复合物是否通过明亮的青色信号从溶酶体中逃逸，FITC 的绿色荧光信号与 DAPI 的蓝色荧光信号结合。如图5a所示，在细胞核内的积累中观察到绿色信号，PEI/siRNA与细胞孵育8 h后出现明亮的青色信号，表明PEI/siRNA已从溶酶体中逸出。然而，PEG-GO-PEI-FA 和 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 早在 2 h 就有一些微弱的绿色信号穿透细胞核，并且随着孵育时间的增加，绿色信号在细胞核中积累。当 PEG-GO-PEI-FA 和 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 与细胞孵育 4 h 时，出现明亮的青色信号（图 5b、c）。这表明这些物质很早就从溶酶体中逸出。总之，这些结果表明PEG-GO-PEI-FA和PEG-GO-PEI-FA/siRNA仍具有良好的内体或溶酶体逃逸能力，可有效促进溶酶体逃逸和体外基因转染。

CLSM 观察到的 PEG-GO-PEI-FA 的细胞内化和溶酶体逃逸。用a培养的SKOV3卵巢癌细胞 裴，b PEG-GO-PEI-FA 和 c PEG-GO-PEI-FA 0.5、1、2、4 和 8 小时。蓝色的是DAPI染色的细胞核，绿色的是FITC标记的纳米复合物，红色的是LysoTracker红色染色后的核内体和溶酶体荧光。比例尺代表100 μm，但在单格中比例尺为10 μm

PEG-GO-PEI-FA/siRNA 的细胞抑制评估

在目前的情况下，PEG-GO-PEI-FA/siRNA 的治疗效果通过 CCK-8 测定在体外对 SKOV3 细胞进行了检查。如图6a所示，我们没有发现PEG-GO-PEI中不同浓度（10-100 μg/mL）和不同时间点（12和24 h）对肿瘤细胞存活率的显着影响。 FA组。即使浓度超过100 μg/mL，肿瘤细胞的存活率仍超过80%。因此，我们为下一个细胞抑制研究选择了 100 μg/mL。 PEG-GO-PEI/siRNA和Lipo2000/siRNA组细胞毒性较弱（抑制率小于20%）。与PEG-GO-PEI/siRNA和Lipo2000/siRNA相比，PEG-GO-PEI-FA/siRNA对SKOV3肿瘤细胞的生长有显着的抑制作用。 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 以时间依赖性方式抑制 SKOV3 细胞（图 6b）。这些结果表明PEG-GO-PEI-FA/siRNA对肿瘤细胞增殖的抑制效果最好，可以将PEG-GO-PEI-FA作为理想的基因传递纳米载体。

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. 一 SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; *p <0.05 (Student’s t test)

Conclusions

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章及其补充信息文件中。

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

CCK-8:

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM:

Confocal laser scanning microscope

DAPI：

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS：

动态光散射

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB:

Ethidium bromide

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA：

Folic acid

FBS：

胎牛血清

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FITR:

傅里叶变换红外光谱

FR:

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

开始：

氧化石墨烯

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS：

N -hydroxysuccinimide

NP：

纳米粒子

PBS：

Phosphate-buffered solution

PDI：

多分散指数

PEG：

聚乙二醇

PEI：

Polyethyleneimine

siRNA:

Small interfering RNA